Википедия

Иммунопреципитация

Иммунопреципита́ция — метод выделения белка из сложных смесей, таких как клеточные лизаты, сыворотки и тканевые гомогенаты, при помощи специфичных к белку антител. Иммунопреципитация позволяет детектировать изменения экспрессии белка, характеризовать белки, с которыми исследуемый белок образует комплекс, выявлять сайты связывания белка с нуклеиновыми кислотами[1].

Методология править

При проведении иммунопреципитации антитела связывают на микрогранулах. Чаще всего используются микрогранулы из агарозы. Также могут быть использованы микрогранулы, обладающие магнитными свойствами. При помощи магнита магнитные микрогранулы, несущие комплексы антиген-антитело[en], могут быть удержаны в пробирке во время удаления из неё не связавшихся с антителом компонентов образца[1].

В зависимости от способа связывания антител на микрогранулах, различают три технологии иммунопреципитации. В классической технологии применяются микрогранулы, покрытые белком A или белком G. Белок A, как и белок G, может связываться с Fc-областью широкого спектра антител. Антитело, специфичное к выделяемому белку, инкубируют со смесью, из которой планируют выделить данный белок. После образования комплекса выделяемого белка (антигена) с антителом в смесь вводят микрогранулы, покрытые белком A или белком G. Комплексы антиген-антитело связываются на микрогранулах. При помощи центрифугирования и промывки, микрогранулы со связанными комплексами антиген-антитело отделяют от смеси. Антиген и антитело элюируют с микрогранул. Иногда в смесь вводят микрогранулы, с которыми были предварительно связаны антитела. Основной недостаток классической технологии заключается в том, что при элюции выделяемого белка с микрочастицы антитело также будет снято с микрочастицы. В результате, выделяемый белок будет загрязнен, и антитела нельзя будет использовать повторно[1].

Загрязнения выделяемого белка и потери антител можно избежать путём иммобилизации антител на микрочастице. Существует две технологии: иммобилизация за счёт ковалентной сшивки антитела и белка A или белка G, расположенного на поверхности микрочастицы, и иммобилизация за счёт образования ковалентной связи между антителом и материалом микрочастицы. Эти технологии также имеют свои недостатки. Недостаток ковалентной сшивки антитела и белка A или белка G заключается в том, что сшивающий реагент может образовывать ковалентные связи в произвольных участках антитела, повреждая активный центр, и, как следствие, антитело теряет способность связывать антиген. Недостаток ковалентной сшивки антитела и материала микрочастицы состоит в том, что, в отличие от технологий с использованием белка A или белка G, произвольный участок антитела свяжется с микрочастицей, что может привести к потере способности антитела связывать антиген[1].

В ситуации, когда антитела к выделяемому белку недоступны, к нему, с использованием генно-инженерных методов, может быть пришит тег (например, FLAG-тэг[en]), к которому антитела доступны[2].

К достоинствам иммунопреципитации стоит отнести то, что в этом методе антигены взаимодействуют с антителами в их нативной конформации[en] для дальнейшего разделения и количественного анализа. Более того, метод иммунопреципитации позволяет концентрировать белок. Недостаток метода состоит в том, что для эффективного обнаружения белок должен быть радиоактивно мечен[3].

Разновидности иммунопреципитации править

 
Принцип ChIP-seq

Ко-иммунопреципитация править

 
Ко-иммунопреципитация

Ко-иммунопреципитация (Co-IP) — это иммунопреципитация целого белкового комплекса, которая основана на использовании антитела, специфичного к одному из белков, входящих в состав комплекса. Связывая этот белок, антитело связывает весь комплекс. В результате появляется возможность идентифицировать все белки, входящие в состав комплекса[1].

Иммунопреципитация хроматина править

Иммунопреципитация хроматина[en] (ChIP) — метод нахождения сайтов связывания исследуемого ДНК-связывающего белка[en] в геноме. Для этого ДНК выделяют из клетки и режут на небольшие фрагменты, а затем проводят иммунопреципитацию, используя антитела к исследуемому ДНК-связывающему белку. В результате с антителами связываются комплексы, состоящие из исследуемого ДНК-связывающего белка и фрагмента ДНК. Такие фрагменты ДНК и есть сайты связывания исследуемого ДНК-связывающего белка в геноме. Для чтения нуклеотидной последовательности данных фрагментов ДНК используют ДНК-микрочипы (ChIP-on-chip) или современные методы секвенирования (ChIP-seq)[4][5].

Иммунопреципитация РНК править

Иммунопреципитация РНК (RIP) — метод, позволяющий идентифицировать молекулы РНК, взаимодействующие с исследуемым РНК-связывающим белком, и определять сайты связывания исследуемого белка с молекулами РНК. Процедура иммунопреципитации РНК аналогична иммунопреципитации хроматина. Для чтения нуклеотидной последовательности выделенных фрагментов РНК используют ДНК-микрочипы, предварительно получив комплементарные выделенным фрагментам молекулы ДНК (RIP-chip), или современные методы секвенирования (RIP-seq)[6].

Примечания править

  1. ↑ 1 2 3 4 5 Kaboord B., Perr M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. (англ.) // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). — 2008. — Vol. 424. — P. 349—364. — doi:10.1007/978-1-60327-064-9_27. — PMID 18369874. [исправить]
  2. ↑ Brizzard B. L., Chubet R. G., Vizard D. L. Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution. (англ.) // BioTechniques. — 1994. — Vol. 16, no. 4. — P. 730—735. — PMID 8024796. [исправить]
  3. ↑ Stephen Thompson. Immunoprecipitation and Blotting // Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine™. — 2004. — Vol. 94. — P. 33—45. — doi:10.1385/1-59259-679-7:33. Архивировано 2 июня 2018 года.
  4. ↑ Hoffman B. G., Jones S. J. Genome-wide identification of DNA-protein interactions using chromatin immunoprecipitation coupled with flow cell sequencing. (англ.) // The Journal of endocrinology. — 2009. — Vol. 201, no. 1. — P. 1—13. — doi:10.1677/JOE-08-0526. — PMID 19136617. [исправить]
  5. ↑ Lee T. I., Johnstone S. E., Young R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. (англ.) // Nature protocols. — 2006. — Vol. 1, no. 2. — P. 729—748. — doi:10.1038/nprot.2006.98. — PMID 17406303. [исправить]
  6. ↑ Keene J. D., Komisarow J. M., Friedersdorf M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. (англ.) // Nature protocols. — 2006. — Vol. 1, no. 1. — P. 302—307. — doi:10.1038/nprot.2006.47. — PMID 17406249. [исправить]

Литература править

  • Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. Молекулярная биология клетки / Перевод с английского А. Н. Дьяконовой, А. В. Дюбы и А. А. Светлова. Под ред. Е. С. Шилова, Б. П. Копнина, М. А. Лагарьковой, Д. В. Купраша.. — М.—Ижевск: НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика», 2013. — Т. 1. — С. 663—665. — 1052 с. — ISBN 978-5-4344-0137-1.

Ссылки править

Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=Иммунопреципитация&oldid=127692722