Метод реплик (микробиология)

Реплики - это микробиологический метод, при котором одна или несколько вторичных чашек Петри, содержащих различные твердые (на основе агара) селективные среды роста (лишенные питательных веществ или содержащие химические ингибиторы роста, такие как антибиотики), инокулируются теми же колониями микроорганизмов из первичной чашки Петри, воспроизводя первоначальную пространственную картину расположения бактериальных колоний относительно друг друга.

Отрицательный отбор путем посева на реплики для скрининга колоний, чувствительных к ампициллину.

История

В 1925 году Эстер и Джошуа Ледерберг предложили метод размножения колоний.

Ледерберг стремился использовать ткань, которую можно стерилизовать, а также имеющую вертикальный ворс, напоминающий двухмерную аналоговую «проволочную щетку» — классический инструмент для переноса колоний.

Первоначально, использовались бумага и нейлоновый бархат, однако использование этих покрытий было, в дальнейшем, прекращено из-за ряда проблем, например, бумага искажала исходный паттерн бактериальной колонии, а нейлоновый бархат оказался слишком дорогим. Таким образом, в качестве покрытия для штампа был выбран хлопковый вельвет.

Метод реплик находит своё применение в микробиологии как про-(бактерии), так и эукариот (дрожжи).

Метод

Для переноса используется штамп Ледерберга: стерильная бархатная ткань натягивается на цилиндр с диаметром, подобным внутреннему диаметру чашки Петри. Сначала этот штамп прижимают к исходной чашке Петри, заросшей колониями, а затем с ещё не заросшей. Перенос материала из каждой колонии в одинаковом расположении на ещё не проросшую чашку, которая инкубируется для выращивания колоний.

Ворсовые волокна бархата предотвращают размазывание колоний. Таким образом, с исходной чашки Петри (матрицы), покрытой колониями, можно сделать несколько оттисков на различные гелевые среды.

Как правило, переносу подвергается ~30-300 колоний из-за сложности выделения каждой колонии по-отдельности.

Применение

Метод реплик может быть использован для поиска и выделения дефицитных мутантов, то есть микроорганизмов, которые, в отличие от родительского штамма, не способны производить определённые вещества, необходимые для их роста и размножения, и поэтому зависят от присутствия этих веществ в культуральной среде.

• Очистка культуры.
• Обогащение мутантами.
• Доказательство спонтанности мутаций.
• Резистентность к антимикробным средствам.
• Выявление ауксотрофии.

Литература

Arnold Berk, David Baltimore, Harvey Lodish, James Darnell, Paul Matsudaira, S. Lawrence Zipursky: Molekulare Zellbiologie. 2. Auflage, Walter de Gruyter, 1996. ISBN 9783110810578. S. 199.

Ссылки

• Lederberg, J and Lederberg, EM (1952) Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J Bacteriol. 63: 399—406.[1]
• Lederberg, J. (1989). «Replica Plating and Indirect Selection of Bacterial Mutants: Isolation of Preadaptive Mutants in Bacteria by Sib Selection». https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1203627/ Genetics. 121 (3). PMID 2653959. Retrieved 2021-07-27.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC169282/
• Treco, Douglas A.; Winston, Fred (2008). «Growth and Manipulation of Yeast». Current Protocols in Molecular Biology. Wiley. 82 (1). doi:10.1002/0471142727.mb1302s82. ISSN 1934-3639.https://doi.org/10.1002%2F0471142727.mb1302s82 https://www.worldcat.org/issn/1934-3639