Полимеразная цепная реакция: различия между версиями

* '''Вложенная ПЦР''' ([[:en:Nested PCR|nestedNested PCR]]{{ref-en}}) — применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.

* '''Инвертированная ПЦР''' ([[:en:Inverse PCR|inverseInverse PCR]]{{ref-en}}) — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК [[рестриктаза]]ми с последующим соединением фрагментов ([[Лигаза#ДНК-лигазы|лигирование]]). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.

* [[ОТ ПЦР|'''ПЦР с обратной транскрипцией''']] ([[RT PCR|reverseReverse transcriptionTranscription PCR, RT-PCR]]{{ref-en}}) — используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице [[мРНК]] синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью [[ревертазы]] и получают одноцепочечную [[кДНК]], которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда [[экспрессия генов|экспрессируются]] данные гены.

* '''Асимметричная ПЦР''' ({{lang-en|asymmetricAsymmetric PCR}}) — проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках [[секвенирование|секвенирования]] и [[Гибридизация ДНК|гибридизационного]] анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке. Модификаций этого метода является {{lang-en|''L''inear-''A''fter-''T''he-''E''xponential-PCR }}(LATE-PCR), в котором используются праймеры с разной концентрацией, и праймер с низкой концентрацией подбирается с высокой ([[Гибридизация ДНК|температурой плавления]]), чем праймер с высокой концентрацией. ПЦР проводят при высокой температуре отжига, тем самым удаётся поддержать эффективности реакции на протяжении всех циклов<ref name="Pierce and Wangh">{{cite journal|author=Pierce KE and Wangh LJ|year= 2007|title=Linear-after-the-exponential polymerase chain reaction and allied technologies Real-time detection strategies for rapid, reliable diagnosis from single cells|journal=Methods Mol Med.|volume=132|pages=65–85|pmid=17876077|doi=10.1007/978-1-59745-298-4_7|series=Methods in Molecular Medicine™|isbn=978-1-58829-578-1}}</ref>.

* [[Real-time PCR|'''Количественная ПЦР''']] ([[:en:Q-PCR|quantitativeQuantitative PCR, Q-PCR]]{{ref-en}}) или '''[[ПЦР в реальном времени]]''' — используется для непосредственного наблюдения за измерением количества конкретного ПЦР продукта в каждом цикле реакции. В этом методе используют флуоресцентно-меченые праймеры или [[ДНК-зонды]] для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления; или используется флуоресцентный интеркалирующий краситель [[:en:SYBR Green I|''Sybr Green I'']] (но лучше использовать '''[http://products.invitrogen.com/ivgn/product/S7575 SYTO 13]'''), который связывается с двухцепочечной ДНК. [[:en:SYBR Green I|''Sybr Green I'']] обеспечивает простой и экономичный вариант для детекции и количественного определения ПЦР-продуктов в ходе ПЦР в режиме реального времени без необходимости использования специфичных флуоресцентных зондов или праймеров. В ходе амплификации краситель ''SYBR Green I'' встраивается в малую бороздку ДНК ПЦР продуктов и испускает более сильный по сравнению с несвязанным красителем флуоресцентный сигнал при облучении синим лазером. ''SYBR Green I'' совместим со всеми известными на сегодняшний день приборами для проведения ПЦР в режиме реального времени. Максимум поглощения для ''SYBR Green I'' находится при длине волны 494 нм. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения — при 290 нм и 380 нм. Максимум испускания для ''SYBR Green I'' находится при длине волны 521 нм (зелёный)<ref>{{cite web|url=http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Research-Tools/Fluorescence-SpectraViewer.html?fileId1=1305dna Fluorescence SpectraViewer|title=Fluorescence SpectraViewer {{!}} Life Technologies|accessdate=2012-10-30}}</ref>.

* '''Ступенчатая ПЦР''' ([[:en:Touchdown PCR|touchdownTouchdown PCR]]{{ref-en}}) — с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Первые циклы проводят при температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной. Это делается для того, чтобы праймер гибридизовался с комплементарной цепью всей своей длиной; тогда как при оптимальной температуре отжига, праймер частично гибридизуется с комплементарной цепью. Частичная гибридизация праймера на геномной ДНК приводит к неспецифической амплификации, если участков связывания для праймера достаточно много. В большинстве случаев, первые десять ПЦР циклов, можно проводить при температуре отжига в 72-75°С, а затем сразу снизить до оптимальной, например до 60-65°С.

* '''Метод молекулярных колоний''' (ПЦР в геле, {{lang-en|colonyColony - PCR colonyColony}}) — [[SDS PAGE|акриламидный гель]] [[полимер]]изуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.

* '''ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК''' ({{lang-en|rapidRapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR}}).

* '''ПЦР длинных фрагментов''' ({{lang-en|longLong-range PCR}}) — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Используют смесь двух полимераз, одна из которых — ''Taq''-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью, обычно это ''Pfu'' полимераза. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесённые первой, так как ''Taq''-полимераза останавливает синтез ДНК если был добавлен не комплементарный нуклеотид. Этот не комплементарный нуклеотид удаляет Pfu полимераза. Смесь полимераз берется в отношении 50:1 или даже меньше 100:1, где ''Taq''-полимеразы берётся в 25—100 раз больше по отношению к ''Pfu''-полимеразе.

* '''[[ДНК-маркер|RAPD]]''' ({{lang-en|randomRandom amplificationAmplification of polymorphicPolymorphic DNA}}), ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (около 10 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удаётся добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов.

* '''ПЦР с использованием горячего старта''' ({{lang-en|hotHot-start PCR}}) — модификация ПЦР с использованием ДНК-полимеразы, в которой полимеразная активность блокируется при комнатной температуре антителами или имитирующие антитела [[:en:Affibody molecule|небольшими молекулами типа Affibody]], то есть в момент постановки реакции до первой денатурации в ПЦР. Обычно первая денатурация проводится при 95 °C в течение 10 минут.