Метод Циля — Нильсена: различия между версиями

Нет описания правки
м (Орфография, typos fixed:   →)
[[Файл:Mycobacterium tuberculosis Ziehl-Neelsen stain 02.jpg|thumb|Изображение окрашенных клеток ''[[Mycobacterium tuberculosis]]'']]
 
'''Метод окраски по Цилю — Нильсену''' (по Цилю  — Нельсену<ref>В русскоязычной литературе допускается двоякое написание</ref>)  — метод окраски микроорганизмов для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей [[туберкулёз]]а, [[микобактериоз]]ов, [[Проказа|лепры]]), [[Актиномицеты|актиномицетов]] и других кислотоустойчивых [[микроорганизм]]ов. Кислотоустойчивость микроорганизмов обусловлена наличием в их клетках [[Липиды|липидов]], [[воск]]а и [[Гидроксикислоты|оксикислот]]. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведёнными растворами красителей. Для облегчения проникновения красителя в клетки микроорганизмов нанесённый на препарат [[Фенол|карболовый]] [[фуксин Циля]] подогревают над пламенем горелки.
Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спирта.
 
Метод назван именами немецких медиков — микробиолога [[Циль, Франц|Франца Циля]] и патологоанатома [[Нельсен, Фридрих|Фридриха Нельсена]] (Нильсена), которые разработали его в [[1882]]—[[1883]]  гг.
 
== Приготовление ==
 
=== Приготовление растворов ===
 
* Раствор 1. Насыщенный спиртовой раствор фуксина:
растереть в ступке 0,3 г основного фуксина с 2 — 3 каплями глицерина, добавить по каплям 10 мл 96- этилового спирта.
в 90 мл полученного раствора фенола (2) добавить 10 мл насыщенного раствора фуксина (1).
* Раствор 4. Обесцвечивающие растворы:
** Раствор серной кислоты. К 75 мл дистиллированной воды осторожно долить 25 мл концентрированной серной кислоты, постепенно наслаивая её по стенкам сосуда. Смешать. Содержимое нагреется. '''Никогда не добавляйте воду в кислоту!'''
'''а) Раствор серной кислоты'''
** Раствор солянокислого спирта. Вместо раствора серной кислоты для обесцвечивания можно использовать 3 % солянокислый спирт: Этиловый спирт 96 % — 97 мл, Концентрированная соляная кислота — 3 мл. К 97 мл спирта осторожно добавляют 3 мл концентрированной соляной кислоты. '''Всегда осторожно вливайте кислоту в спирт, но не наоборот.'''
 
<blockquote>К 75 мл дистиллированной воды осторожно долить 25 мл
концентрированной серной кислоты, постепенно наслаивая её по стенкам
сосуда. Смешать. Содержимое нагреется.</blockquote>
 
'''Никогда не добавляйте воду в кислоту!'''
 
'''б) Раствор солянокислого спирта'''
 
<blockquote>Вместо раствора серной кислоты для обесцвечивания можно
использовать 3% солянокислый спирт:
Этиловый спирт 96- 97 мл
Концентрированная соляная кислота 3 мл.
К 97 мл спирта осторожно добавляют 3 мл концентрированной
соляной кислоты.
'''Всегда осторожно вливайте кислоту в спирт, но не наоборот.'''</blockquote>
 
* Раствор 5. Рабочий раствор метиленового синего:
растворить 0,3 г хлорида метиленового синего в 100 мл дистиллированной воды.
 
== Этапы окраски ==
1.* Фиксированный мазок, депарафинизированный срез, покрывают плоской фильтровальной бумагой и наливают на неё [[Фенол|карболовый]] [[фуксин]] Циля. Мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров, затем отводят для охлаждения и добавляют новую порцию красителя. Подогревание повторяют 2—3 раза. После охлаждения снимают фильтровальную бумагу и промывают препарат водой.
2.* Препарат обесцвечивают путём погружения или нанесения на него 25%-го раствора [[Серная кислота|серной кислоты]] или 3 % солянокислого спирта в течение 30 секунд, и промывают несколько раз водой<ref name="fsvok">{{Cite web |url=http://www.fsvok.ru/downloads/c7m7i88/modul_viyvlenie_tb_metodom_micro_baza_end_50-73_str.pdf |title=Микроскопические методы выявления ТБ. Часть 2. Учебное пособие, предназначенное для обучения микроскопическим методам выявления ТБ. Пособие является частью Курса обучения выявления туберкулёза микробиологическими методами. |accessdate=2013-04-10 |archiveurl=https://web.archive.org/web/20121021012429/http://www.fsvok.ru/downloads/c7m7i88/modul_viyvlenie_tb_metodom_micro_baza_end_50-73_str.pdf |archivedate=2012-10-21 |deadlink=yes }}</ref><ref name="109 приказ">{{книга
 
2. Препарат обесцвечивают путём погружения или нанесения на него 25%-го раствора [[Серная кислота|серной кислоты]] или 3 % солянокислого спирта в течение 30 секунд, и промывают несколько раз водой<ref name="fsvok">{{Cite web |url=http://www.fsvok.ru/downloads/c7m7i88/modul_viyvlenie_tb_metodom_micro_baza_end_50-73_str.pdf |title=Микроскопические методы выявления ТБ. Часть 2. Учебное пособие, предназначенное для обучения микроскопическим методам выявления ТБ. Пособие является частью Курса обучения выявления туберкулёза микробиологическими методами. |accessdate=2013-04-10 |archiveurl=https://web.archive.org/web/20121021012429/http://www.fsvok.ru/downloads/c7m7i88/modul_viyvlenie_tb_metodom_micro_baza_end_50-73_str.pdf |archivedate=2012-10-21 |deadlink=yes }}</ref><ref name="109 приказ">{{книга
|заглавие = Приказ минздрава РФ от 21.03.2003 № 109
|год = 2003
}}</ref>.
 
3.* Окрашивают препараты '''водно-спиртовым''' раствором [[Метиленовый синий|метиленового синего]] 1 минуту, промывают водой и высушивают.
 
При окраске по этому методу кислотоустойчивые бактерии приобретают интенсивно [[красный цвет]], остальная микрофлора окрашивается в светло-[[синий цвет]]<ref name="109 приказ" />.
 
=== Морфологические характеристики кислотоустойчивых микобактерий после окраски ===
Кислотоустойчивые [[микобактерии]] [[Туберкулёз|туберкулёзатуберкулёз]]а имеют в длину примерно 1 — 10 мкм, в ширину — 0,2 — 0,6 мкм.
Обычно они видны в виде тонких изящных палочек, но иногда можно обнаружить изогнутые или извитые варианты. При окраске [[Фенол|карболовым]] [[фуксин]]ом микобактерии туберкулёза выявляются в виде тонких, слегка изогнутых палочек малиново-красного цвета, содержащих различное количество гранул. Микроорганизмы, располагающиеся поодиночке, парами или в виде групп, хорошо выделяются на голубом фоне других компонентов препарата. Нередко бактериальные клетки могут располагаться в виде римской цифры «V».
 
 
=== Порядок проведения микроскопического исследования ===
При микроскопическом исследовании мазка следует просматривать не менее 100 полей зрения, чтобы дать количественную оценку препарату и обнаружить единичные микобактерии. В том случае, если результат такого исследования оказывается отрицательным, для подтверждения просматривают дополнительно 200 полей зрения. При значительном количестве кислотоустойчивых микобактерий достаточно исследовать 20 — 50 полей зрения как при окраске по Циль-Нильсену, так и при люминесцентной микроскопии (см. '''таблицу'''). При микроскопическом исследовании препарата необходимо быть уверенным, что ни одно поле зрения препарата не просматривается повторно, поэтому рекомендуется просматривать препарат всегда по одной и той же схеме:
При микроскопическом исследовании мазка следует просматривать не менее 100 полей зрения,
чтобы дать количественную оценку препарату и обнаружить единичные микобактерии. В том случае, если результат такого исследования
оказывается отрицательным, для подтверждения просматривают дополнительно 200 полей зрения.
При значительном количестве кислотоустойчивых микобактерий достаточно исследовать 20 — 50 полей зрения как при окраске по
Циль-Нильсену, так и при люминесцентной микроскопии (см. '''таблицу''').
При микроскопическом исследовании препарата необходимо быть уверенным, что ни одно поле зрения препарата не просматривается
повторно, поэтому рекомендуется просматривать препарат всегда по одной и той же схеме:
* либо 3 параллельных прохода по длине препарата;
* либо 9 параллельных проходов по ширине.
 
Просматривать препарат начинают с левого верхнего выбранного в мазке поля зрения, постепенно передвигаясь либо вдоль продольной
Просматривать препарат начинают с левого верхнего выбранного в мазке поля зрения, постепенно передвигаясь либо вдоль продольной оси препарата до конца мазка, либо смещаясь вниз и затем вновь поднимаясь вверх и т. д., проходя все поля зрения до границы мазка. При увеличении микроскопа 1000x, то есть 100x для масляно-иммерсионного объектива и 10x для окуляра, при исследовании одной длины мазка (~ 20 мм) за один продольный проход просматривается около 100—120 полей зрения (диаметр поля зрения
При увеличении микроскопа 1000x, то есть 100x для масляно-иммерсионного объектива и 10x для окуляра, при
исследовании одной длины мазка (~ 20 мм) за один продольный проход просматривается около 100—120 полей зрения (диаметр поля зрения
— 0,16 — 0,2 мм).
<center>
| 300 || ОТР. || Отрицательный
|-
! 1 - — 2 КУМ в 300 п/з
| 300 || Рекомендуется повторить исследование || Результат не оценивается
|-
! 1 - — 9 КУМ в 100 п/з
| 100 || "«_N__"» КУМ в 100 п/з<ref>Указать точное число КУМ.</ref> || Положительный
|-
! 10 - — 99 КУМ в 100 п/з
| 100 || 1+<ref name="tabu">Соответствие градаций:
Точное число - единичные КУМ в препарате;
3+ - значительное количество КУМ.</ref> || Положительный
|-
! 1 - — 10 КУМ в 1 п/з
| 50 || 2+<ref name="tabu" /> || Положительный
|-