Флуоресценция в биологических исследованиях: различия между версиями

(отмена правки 107693297 участника 94.245.133.190 (обс.) -вандализм)
Метка: отмена
 
=== Секвенирование ДНК ===
[[Файл:Секвенирование ДНК по Сангеру.jpg|420пкс|мини|Секвенирование ДНК по Сенгеру]]
[[Секвенирование]]м называют определение последовательности нуклеотидов в цепи нуклеиновой кислоты<ref>Franca, L. T. C., Carrilho, E., & Kist, T. B. L. A review of DNA sequencing techniques // Quarterly Reviews of Biophysics 35 (2002) (02) С. 169—200. DOI:10.1017/S0033583502003797.</ref>. Первые методы секвенирования были разработаны в [[1970-е|1970-х]] годах XX столетия. Ими были метод химической деградации Максама — Гилберта<ref>Maxam, A. M.; Gilbert, W. [http://www.pnas.org/content/74/2/560.abstract A new method for sequencing DNA] // Proceedings of the National Academy of Sciences 74 (1977) (2) С. 560—564.</ref> и метод, базирующийся на использовании дидезокситерминаторов по [[Сенгер, Фредерик|Сенгеру]]<ref>Sanger, F.; Nicklen, S.; Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proceedings of the National Academy of Sciences 74 (1977) (12) С. 5463-5467.</ref>. Суть последнего состояла в [[Ферменты|энзиматическом]] удлинении [[праймер]]а (короткого [[олигонуклеотид]]а-затравки известной структуры) на молекуле [[ДНК]] неизвестной последовательности в присутствии специальных химически-модифицированных [[Нуклеозиды|нуклеозидов]] — дидезокситерминаторов. Они похожи на обычные нуклеозид-трифосфаты, которые являются исходными соединениями для синтеза ДНК в организме, но отличаются от них отсутствием 3'-гидроксильной группы. Эти химические соединения могут инкорпорироваться в последовательность ДНК, которая синтезируется [[ДНК-полимераза|ДНК-полимеразой]]. Но после инкорпорации дидезокситерминатора синтез обрывается из-за отсутствия свободного 3'-гидроксила для образования нового фосфодиэстерной связи с последующим нуклеозидом.
 
В оригинальном [[Метод Сэнгера|методе Сэнгера]] использовалось энзиматическое удлинение [[праймер]]а, меченного [[Радиоактивные изотопы|радиоактивным изотопом]] (<sup>32</sup>Р на 5’гидроксильной группе) в четырёх разных пробирках. К каждой из них добавлялся небольшой процент одного определённого дидезокситерминатора. Из-за этого синтез в каждой пробирке обрывался в определённый момент, но всегда на позиции того нуклеотида, который был в форме дидезокситерминатора. ПоКроме [[Теорияиспользования вероятностей|теориирадиоактивных вероятности]]изотопов, вдругим смеси,недостатком содержащейэтого метода было большое количество вновь образовавшихся молекул ДНКопераций, накапливалисьнеобходимое вседля возможныеобнаружения последовательности,и терминированныесчитывания нарадиоактивного всех возможных позицияхсигнала, которыеа содержаттакже нуклеотид,необходимость присутствующийиспользования вчетырёх формедорожек ddNTP.для Послекаждого завершенияанализа, реакциипотому всечто четыреневозможно реакционныебыло смеси разделялись в [[полиакриламид]]ном геле на четыреразличить разные дорожки,терминированные распределение радиоактивных фрагментов считывалось [[радиоавтография|радиоавтографией]], после чего последовательность неизвестной ДНК можно былофрагменты прочитатьтолько прямопо наих снимкерадиоактивности.
[[Файл:Флуоресцентные дидезокситерминаторы Сангер.svg|360пкс|мини|слева|Флуоресцентные дидезокситерминаторы для автоматического секвенирования по Сенгеру]]
В оригинальном [[Метод Сэнгера|методе Сэнгера]] использовалось энзиматическое удлинение [[праймер]]а, меченного [[Радиоактивные изотопы|радиоактивным изотопом]] (<sup>32</sup>Р на 5’гидроксильной группе) в четырёх разных пробирках. К каждой из них добавлялся небольшой процент одного определённого дидезокситерминатора. Из-за этого синтез в каждой пробирке обрывался в определённый момент, но всегда на позиции того нуклеотида, который был в форме дидезокситерминатора. По [[Теория вероятностей|теории вероятности]], в смеси, содержащей большое количество вновь образовавшихся молекул ДНК, накапливались все возможные последовательности, терминированные на всех возможных позициях, которые содержат нуклеотид, присутствующий в форме ddNTP. После завершения реакции все четыре реакционные смеси разделялись в [[полиакриламид]]ном геле на четыре разные дорожки, распределение радиоактивных фрагментов считывалось [[радиоавтография|радиоавтографией]], после чего последовательность неизвестной ДНК можно было прочитать прямо на снимке.
 
[[Файл:Флуоресцентные дидезокситерминаторы Сангер.svg|360пкс|мини|слева|Флуоресцентные дидезокситерминаторы для автоматического секвенирования по Сенгеру]]
Кроме использования радиоактивных изотопов, другим недостатком этого метода было большое количество операций, необходимое для обнаружения и считывания радиоактивного сигнала, а также необходимость использования четырёх дорожек для каждого анализа, потому что невозможно было различить разные терминированные фрагменты только по их радиоактивности.
 
Метод секвенирования с дидезокситерминаторами был существенно усовершенствован, когда радиоактивное мечение [[праймер]]а было заменено на флуоресцентное мечение терминальных нуклеотидов. На рисунке показана структура дидезоксинуклеозид-трифосфатов, которые содержат флуоресцентные красители, привязанные [[Ковалентная связь|ковалентными связями]] к [[Азотистые основания|азотистым основаниям]]. Было обнаружено, что такие модификации азотистых оснований минимально влияют на распознавание трифосфатов [[ДНК-полимераза]]ми, поэтому они могут встраиваться в синтезированную ДНК наряду с обычными дНТФ. В случае с флуоресцентными дидезокситерминаторами при терминации синтеза ДНК происходит её флуоресцентное мечение. Использование флуоресцентных красителей четырёх цветов для кодирования каждого из природных нуклеозидов позволило проводить синтез в одной пробирке и разделение на одной дорожке геля. Более того, флуоресцентная детекция оказалась более чувствительной и быстрой по сравнению с радиоактивной, позволяя проводить определение нуклеотидов в реальном времени.