Протеомика: различия между версиями

'''Протео́мика''' ({{lang-en|Proteomics}}) — область [[Молекулярная биология|молекулярной биологии]], посвящённая идентификации и количественному анализу [[Белок|белков]] (иными словами, высокопроизводительному исследованию белков). Термин «протеомика» был предложен в 1997 году<ref>{{cite pmid|9634650}}</ref>.

Объектом изучения протеомики являются белки, которые [[Экспрессия генов|экспрессируются]] в данной [[Клетка (биология)|клетке]], [[Ткань (биология)|ткани]] или организме в данный момент времени (то есть протеом). Хотя первые методы протеомики, например, [[Секвенирование по Эдману|секвенирование белков по Эдману]], появились задолго до геномных[[геном]]ных технологий, действительно высокопроизводительное изучение белков стало возможным только в постгеномную эпоху, то есть при наличии известных [[Нуклеотидная последовательность|нуклеотидных последовательностей]] геномов разных организмов.

Количественный анализ белков с ферментативной[[ферментат]]ивной активностью можно опосредованно проводить через {{нп5|Измерение активности фермента|определение активности|en|Enzyme assay}} этих белков. Ещё в начале XX века подобный анализ можно было осуществить с помощью методов [[Спектрофотометрия|спектрофотометрии]]. При этом количество катализатора[[катализатор]]а оценивается в условных единицах активности. Условные единицы активности до сих пор используют для описания концентрации в [[Кровь|крови]] таких биомаркеров[[биомаркер]]ов, как [[аланиниаминотрансфераза]] и [[аспартатаминотрансфераза]]. В 1975 году были изобретены [[моноклональные антитела]], которыеи они быстро нашли применение в исследовании белков. Например, если известен [[антиген]] данного [[антитела]], то с помощью антителэтого антитела можно идентифицировать этотисследуемый антиген в исследуемомэкспериментальном образце. В медицине в качестве биомаркеров и сейчас широко используются антитела, антигены которых неизвестны, но которые связывают у больных людей гораздо больше антигена, чем у здоровых. Например, [[гликопротеин]] [[CA-125]] использовали как биомаркер [[Рак яичника|рака яичников]] с 1981 года, когда были получены антитела к нему. Значительно позднее идентифицировали сам белок — муцин 16<ref>{{cite doi|10.1172/JCI110380}}</ref>.

В 1950-х годах [[Швеция|шведский]] [[химик]] {{нп5|Эдман, Пер Виктор|Пер Эдман|en|Pehr Victor Edman}} изобрёл метод определения [[Аминокислоты|аминокислотной]] последовательности белков (секвенирование). Первым этапом секвенирования по Эдману является обработка исследуемого пептида [[Изотиоцианаты|изотиоцианатом]] фенила[[фенил]]а, который взаимодействует с [[Аминогруппа|аминогруппой]], давая фенилтиокарбомоильный [[Радикал (химия)|радикал]]. При умеренном закислении раствора он отщепляется, захватывая вместе с собой [[N-Конец|N-концевую]] аминокислоту. В результате в раствор выходит тиазолинон с радикалом, специфичным для данной аминокислоты. Это производное анализируют [[Хроматография|хроматографически]], определяя, какая аминокислота была на N-конце, и цикл повторяется. Если исследуемый белок закреплён на твёрдой подложке, то после каждой обработки изотиоцианатом фенила его можно промывать, удаляя тиазолинон с N-концевой кислотой, и начинать новый цикл. Метод Эдмана позволяет с высокой точностью определять последовательность длиной до 30 аминокислотных остатков. Метод также очень чувствителен: он позволяет секвенировать менее 0,1 [[Моль (единица измерения)|нмоль]] пептида[[пептид]]а с 99% точностью. В 1960-х был создан автоматический секвенатор, реализующий метод Эдмана. Метод Эдмана изредка используют и сейчас при исследовании организмов, геномные последовательности которых неизвестны<ref>{{cite doi|10.3891/acta.chem.scand.04-0283}}</ref><ref>{{cite pmid|6059350}}</ref><ref>{{cite doi|10.1016/S0076-6879(73)27039-8}}</ref>.

В 1970—1980-х годах достигли расцвета методы выделения и очистки белков. Эти методы сочетали принципы хроматографии, электрофореза[[электрофорез]]а и [[Центрифугирование|центрифугирования]]; многие из них давно вышли из употребления, но некоторые используются и по сей день. В 1970-м году [[Швейцария|швейцарский]] учёный {{нп5|Лэммли, Ульрих|Ульрих Лэммли|en|Ulrich K. Laemmli}} предложил метод разделения белков при помощи электрофореза в [[Денатурация белка|денатурирующих]] условиях. Сначала белки подвергали жёсткой денатурации под действием [[Лаурилсульфат натрия|додецилсульфата натрия]] ({{lang-en|sodium dodecyl sulphate, SDS}}), который в виде слоя покрывал каждую белковую [[Молекула|молекулу]]. Чем больше белок, тем больше SDS связывалось с ним и тем больший отрицательный [[Заряд (физика)|заряд]] приобретал их комплекс. Поэтому при нанесении образцов в полиакриламидный[[полиакриламид]]ный гель они начинали двигаться по действием [[Электрическое поле|электрического поля]], причём скорость движения белковых молекул зависит от их массы (более лёгкие белки перемещаются по гелю быстрее). Метод хорошо подходит для разделения белков с массой от 5 до 250 [[Дальтон (единица измерения)|кДа]]<ref>{{cite doi|10.1038/227680a0}}</ref>.

Метод Лэммли получил дальнейшее развитие. В 1975 году Патрик О’Фарелл и Йоахим Клозе независимо предложили принцип так называемого {{нп5|Двумерный гень-электрофорез|двумерного электрофореза|en|Two-dimensional gel electrophoresis}}: перед разделением по массе с помощью SDS белки предварительно разделяются согласно их [[Изоэлектрическая точка|изоэлектрической точке]]. Сначала белки вносят в стеклянную трубку, заполненную особыми полимерами[[полимер]]ами, которые создают в ней неподвижный градиент [[Водородный показатель|pH]]. Белки распределяются по трубке, занимая места, pH которых равен их изоэлектрической точке. Далее содержимое трубки выдавливают и приплавляют в гелю для обычного электрофореза по Лэммли. Таким образом, сначала белки делятся по изоэлектрической точке, а потом по массе. В результате двумерного электрофореза каждому белку соответствует не полоса, как при обычном электрофорезе, а сфокусированное округлое пятно, размер и интенсивность окрашивания которого соответствуют концентрации белка. С помощью двумерного электрофореза можно разделять не только различные белки, но и [[Изоформа белка|изоформы]] одного и того же белка, а также формы белка с разными [[Посттрансляционная модификация|посттрансляционными модификациями]]. Были предложены различные усовершенствования методики двумерного электрофореза, некоторые этапы, а также обработка отсканированных гелей, были автоматизированы. По сути, двумерный электрофорез — единственный способ наглядного представления протеома[[протеом]]а<ref>{{cite pmid|236308}}</ref><ref>{{cite pmid|1093965}}</ref><ref>{{cite pmid|18618493}}</ref>.

Дальнейшее развитие белковый гель-электрофорез получил в виде нового метода для идентификации белков в пробе — вестерн-блоттинг. Сначала белки разделяют в полиакриламидном геле, после чего переносят их на особую мембрану, причём полосы располагаются на мембране так же, как на геле. Далее мембрану обрабатывают последовательно двумя видами антител и выявляют полосы, с которыми связались антитела и, следовательно, соответствующие искомому белку<ref>{{cite pmid|91164}}</ref>.

[[Файл:MALDI TOF EN.png|thumb|300px|Схема масс-спектрометра, использующего ионизацию методом MALDI-TOF. Матрица, содержащая исследуемые молекулы, облучается лазером и ионизируется, ионизируя исследуемые пептиды, которые впоследствии и детектируются]]

Масс-спектрометрия включает ряд методов, которые направлены на получение [[Молекулярная масса|молекулярной массы]] исследуемых соединений. Она нашла огромное применение и в [[Биология|биологии]], в особенности, в протеомике. Сначала белки, находящиеся в образце, [[Ионизация|ионизируют]], потом в условиях вакуума [[ионы]] сортируются и детектируются, давая на выходе спектр, который дальше анализируется специальными вычислительными методами. В конечном итоге для каждого иона определяется значение отношения массы к заряду. Если заряд иона равен единице, то отношение численно равно его молекулярной массе. Поначалу использование масс-спектрометрии в биологии было ограничено из-за того, что ионизация была очень жёсткой и приводила к разрушению молекул. В 1980-х годах был разработан метод ионизации молекул лазером при их [[Кристаллизация|сокристаллизации]] со светочувствительным органическим веществом (его называют матрицей). Матрица окружает молекулы исследуемого вещества и под действием лазера ионизирует соседние молекулы. В некоторых условиях ионизацию можно провести без разрушения исследуемых молекул. Этот метод получил название [[Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация|опосредованная матрицей лазерная десорбция-ионизация]] ({{lang-en|matrix-assisted laser desorption ionisation, MALDI}}). Новый метод ионизации совместили с обычным масс-спектрометрометрическим детектором ([[Времяпролётный масс-анализатор|времяпролётным]], {{lang-en|time-of-flight, TOF}}). В этом детекторе ионы движутся в вакуумной[[вакуум]]ной трубке и достигают чувствительной пластины (фотоэлектронного умножителя), которая и является детектором. Время, за которое ион преодолевает длину трубки, обратно пропорционально его массе. В 1990-е и в начале 2000-х метод MALDI-TOF очень активно использовался для исследований белков<ref>{{cite pmid|1789447}}</ref><ref>{{cite doi|10.1016/j.ijms.2014.07.018}}</ref>.

Из-за особенностей изотопного разделения пики в спектрах больших белков чрезвычайно сложно анализировать. По этой причине перед исследованием их с помощью фермента трипсина[[трипсин]]а разрушают на пептиды массой 500—2500 Да, и затем по данным для пептидов восстанавливают информацию об исходном белке подобно тому, как при [[Секвенирование ДНК|секвенировании]] [[Нуклеиновые кислоты|нуклеиновых кислот]] [[Методы секвенирования нового поколения|нового поколения]] исходные последовательности собираются из коротких {{нп5|Прочтение|прочтений|en|Read (biology)}}. Этот подход называется «{{нп5|Протеомика снизу вверх|протеомикой снизу вверх|en|Bottom-up proteomics}}» ({{lang-en|bottom-up}}). Процесс сборки небезошибочен и приводит к большим потерям информации, поэтому в некоторых случаях исследуются целые белки без расщепления с помощью мощных детекторов сверхвысокого разрешения («{{нп5|Протеомика сверху вниз|протеомика сверху вниз|en|Top-down proteomics}}», {{lang-en|top-down}})<ref>{{cite pmid|26795204}}</ref>.

Набор молекулярных масс пептидов, которые были получены при обработке белка трипсином, уникален для каждого белка. Это связано в основном с высокой специфичностью трипсина, который вносит разрез только по остаткамиостаткам лизина[[лизин]]а и аргинина[[аргинин]]а. Сравнивания полученную картину молекулярных масс пептидов для исследуемого белка с пептидными картами белков из [[База данных|баз данных]], можно установить, какой именно белок исследовался. Этот подход получил название пептидной дактилоскопии<ref>{{cite pmid|8962070}}</ref>. Поскольку полного соответствия экспериментального распределения масс пептидов и эталонными пептидными картами достичь невозможно, была введена количественная оценка (score) вероятности того, что экспериментальная пептидная карта соответствует данной теоретической. Для пептидной дактилоскопии были разработаны специальные программы, например, MOWSE<ref>{{cite pmid|15335725}}</ref>.

Вместо фрагментации трипсином перед установкой образцов в [[масс-спектрометр]] фрагментацию белков на фрагменты можно осуществлять в самом масс-спектрометре при помощи, например, столкновения с молекулами [[Инертные газы|инертных газов]]. При этом каждый пептид характеризуется массой иона-предшественника и набором масс ионов-фрагментов. Массы фрагментов можно измерить и по ним восстановить информацию об исходном белке, так как молекулярные массы фрагментов можно найти исходя из последовательности пептида. Такой подход получил название {{нп5|Тандемная масс-спектрометрия|тандемной масс-спектрометрии|en|Tandem mass spectrometry}} (MS-MS). Как и при пептидной дактилоскопии, в тандемной масс-спектрометрии имеет место вероятностная оценка того, что пептидная карта исследуемого белка соответствует одной из теоретических. В 2007 году для анализа данных тандемной масс-спектрометрии был предложен подход target-decoy. Суть этого подхода заключается в том, что при анализе данных к целевым теоретическим пептидам (target) стали добавлять равное количество бессмысленных, фальшивых (decoy) пептидов. Этот подход позволяет оценить качество анализа. Если анализ в качестве лучших соответствий выдаёт соответствие экспериментального белка с заведомо фальшивым, то он даёт {{нп5|Ложноположительные и ложноотрицательные результаты|ложноположительный результат|en|False positives and false negatives}}, а подход target-decoy позволяет оценить долю ложноположительных результатов<ref>{{cite doi|10.1038/nmeth1019}}</ref>.

В качестве альтернативныальтернативы MALDI ионизацию пептидов перед масс-спектрометрией можно осуществлять с помощью метода ионизации электрораспылением, или ионизации [[Электроспрей|электроспреем]] ({{lang-en|electrospray ionisation, ESI}}). Жидкость, содержащая исследуемые белки, помещается в конический капилляр, и, когда она выходит из капилляра, к ней прилагается сильное [[Напряжение (электрическое)|напряжение]]. В результате жидкость превращается в аэрозоль, и при испарении частиц их аэрозоля в потоке инертного газа заряд может переходить на растворённые в аэрозоле [[биомолекулы]], в том числе белки. При таком способе ионизации биомолекулы не разрушаются. Ионизацию электроспреем можно легко совместить с [[Высокоэффективная жидкостная хроматография|высокоэффективной жидкостной хроматографией]]: поток хроматографической фазы с колонки можно направить прямо в капилляр для электрораспыления. Таким образом, масс-спектрометр будет определять массы разделяемых в аналитической колонке молекул. Этот метод обозначают аббревиатурой LC-MS (от англ. {{liquid chromatography-mass spectrometry}})<ref>{{cite pmid|19224008}}</ref>. Идентификация белков в сложном растворе при помощи комбинации масс-спектрометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии получила название протеомики-дробовика, или скорострельной протеомики ({{lang-en|shotgun proteomics}})<ref>{{cite pmid|17990506}}</ref>.

Методы масс-спектрометрии могут быть использованы для направленного обнаружения искомых белков, то есть масс-спектрометр можно настроить таким образом, чтобы он видел только нужный пептид. Для этой цели используют {{нп5|Масс-спектрометр с тройным квадруполем|прибор с детектором типа тройного квадруполя|en|Triple quadrupole mass spectrometer}}, то есть три одинаковых масс-спектрометра, последовательно передающие друг другу ионы. Первый масс-спектрометр отфильтровывает интересующий пептид, во втором он фрагментируется, а третий регистрирует от 3 до 5 заранее выбранных фрагментов. Количественный анализ производится на основе интенсивности фрагментов. Этот метод называется мониторинг множественных реакций ({{lang-en|multiple reaction monitoring, MRM}}), или {{нп5|мониторинг выбранных реакций||en|Selected reaction monitoring}} ({{lang-en|selected reaction monitoring, SRM}})<ref>{{cite doi|10.1074/mcp.M500331-MCP200}}</ref>.

Белковые микрочипы разрабатываются для идентификации определённых белков в образце. По аналогии с [[ДНК-микрочипамимикрочип]]ами, на твёрдую подложку наносятся очень маленькие капли, содержащие антитела. В каждой капле находятся меченные антитела к одному определённому белку, который добавляется на чип в виде {{нп5|Флуоресцентная метка|флуоресцентно-меченной|en|Fluorescent tag}} пробы. После промывки [[флуоресценция]] детектируется только в тех каплях, в которых антитела связали исследуемый белок. Вместо антител можно использовать другие молекулы, специфически взаимодействующие с конкретными белками, например, олигонуклеотиды[[олигонуклеотид]]ы<ref>{{cite pmid|15113093}}</ref>. Белковые микрочипы также можно использовать для обнаружения [[Белок-белковые взаимодействия|белок-белковых взаимодействий]] и определения функций белков. В настоящее время белковые микрочипы автоматизированы. Они обладают высокой чувствительностью и требуют совсем небольшого количества исследуемого белка, благодаря чему отличаются экономичностью<ref>{{cite doi|10.1038/nbt0302-225}}</ref>.

С помощью MALDI-TOF можно определять патогенные[[патоген]]ные микроорганизмы[[микроорганизм]]ы с точностью до [[Род (биология)|родов]] и [[Вид (биология)|видов]]. Интактные [[Бактерии|бактериальные]] клетки наносят на металлическую мишень масс-спектрометра, покрывают матрицей, облучают лазером и получают специфичные профили, которые [[Машинное обучение|обученный]] алгоритм распознаёт по характерным массам<ref>{{cite pmid|19095774}}</ref>.

Исследуется возможность использования протеомики для диагностики [[Рак (заболевание)|раковых]] заболеваний, а также определения степени злокачественности [[Опухоль|опухоли]]. В этом направлении уже достигнуты некоторые успехи. Например, в [[США]] разрешено использование разработанного в 2015 году теста Xpresys Lung, который использует таргетную масс-спектрометрию нескольких белков [[Плазма крови|плазмы крови]] и оценивает степень злокачественности опухолевых узелков в [[Лёгкое|лёгких]]<ref>{{cite pmid|26376647}}</ref>.

Сравнение протеомов двух организмов (необязательно близкородственных) позволяет выявить как общие для этих двух организмов белки, так и белки, которые обуславливаютобусловливают различия их фенотипов[[фенотип]]ов. Такой анализ может давать информацию, полезную для понимания [[Эволюция (биологическая)|эволюционного]] процесса<ref>{{cite pmid|11385598}}</ref> , а иногда это позволяет определить ранее неизвестные функции белков. Например, при помощи сравнительной протеомики были выявлены белки [[Насекомые|насекомого]] ''{{нп5|Nilaparvata lugens||en|Nilaparvata lugens}}'', вовлеченные в процессы, связанные с [[Размножение (биология)|размножением]], чья экспрессия изменяется в ответ на обработку инсектицидами[[инсектицид]]ами<ref>{{cite pmid|21800909}}</ref>.