Протеомика: различия между версиями
| [отпатрулированная версия] | [отпатрулированная версия] |
Содержимое удалено Содержимое добавлено
Minina (обсуждение | вклад) Нет описания правки |
Minina (обсуждение | вклад) |
||
Строка 11:
В 1953 году [[Сенгер, Фредерик|Фредерик Сенгер]] определил [[Аминокислоты|аминокислотную]] последовательность [[гормон]]а [[инсулин]]а. Для мечения и идентификации [[N-конец|N-концевого]] остатка Сэнгер предложил использовать {{нп5|1-фтор-2,4-динитробензол||en|1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene}}. После связывания с этим реагентом N-концевого остатка белка полипептидную цепь [[гидролиз]]уют [[Соляная кислота|соляной кислотой]] до отдельных аминокислот и выявляют меченный остаток. Если белок состоит из нескольких полипептидных цепей, то пометятся оба N-концевых остатка, то есть будет установлено число отдельных полипептидных цепей в белке. Для секвенирования всей белковой последовательности чаще применяют метод секвенирования по Эдману{{sfn|Нельсон и Кокс|2017|с=143—145}}.
В 1950-х годах [[Швеция|шведский]] [[химик]] {{нп5|Эдман, Пер Виктор|Пер Эдман|en|Pehr Victor Edman}} изобрёл метод определения аминокислотной последовательности белков (секвенирование). Первым этапом секвенирования по Эдману является обработка исследуемого пептида [[Изотиоцианаты|изотиоцианатом]] [[фенил]]а, который взаимодействует с [[Аминогруппа|аминогруппой]], давая фенилтиокарбомоильный [[Радикал (химия)|радикал]]. При умеренном закислении раствора он отщепляется, захватывая вместе с собой [[N-Конец|N-концевую]] аминокислоту. В результате в раствор выходит тиазолинон с радикалом, специфичным для данной аминокислоты. Это производное анализируют [[Хроматография|хроматографически]], определяя, какая аминокислота была на N-конце, и цикл повторяется. Если исследуемый белок закреплён на твёрдой подложке, то после каждой обработки изотиоцианатом фенила его можно промывать, удаляя тиазолинон с N-концевой кислотой, и начинать новый цикл. Метод Эдмана позволяет с высокой точностью определять последовательность длиной до 30 аминокислотных остатков. Метод также очень чувствителен: он позволяет секвенировать менее 0,1 [[Моль (единица измерения)|нмоль]] [[пептид]]а с 99% точностью. Длина полипептидной цепи, которую можно секвенировать методом Эдмана, зависит от эффективности отдельных стадий, которая, в свою очередь, определяется аминокислотым составом полипептида{{sfn|Нельсон и Кокс|2017|c=145}}.
[[Файл:EdmanDegradation.png|500px|center|Механизм химической реакции, лежащей в основе секвенирования по Эдману]]
В 1960-х был создан автоматический секвенатор, реализующий метод Эдмана. Первичную структуру инсулина, на определение которой у Сенгера ушло более 10 лет, в настоящее время можно получить за пару дней прямым секвенированием на белковом секвенаторе{{sfn|Нельсон и Кокс|2017|с=145}}. Метод Эдмана сейчас изредка используют при исследовании организмов, геномные последовательности которых неизвестны<ref>{{cite doi|10.3891/acta.chem.scand.04-0283}}</ref><ref>{{cite pmid|6059350}}</ref><ref>{{cite doi|10.1016/S0076-6879(73)27039-8}}</ref>. Традиционное секвенирование белков также применяют в тех случаях, когда многие их особенности (например, посттрансляционные модификации) нельзя узнать только лишь из последовательности гена{{sfn|Нельсон и Кокс|2017|с=143}}.
Стоит отметить, что большинство белков перед секвенированием необходимо приготовить к нему особым образом. Сначала в нём разрушают [[дисульфидные связи]], если они есть, при помощи [[Окисление|окисления]] надмуравьиной кислотой или [[Восстановление (химия)|восстановления]] [[дитиотреитол]]ом. Далее белковую цепь дробят на фрагменты [[
Для определения положения дисульфидных связей белок снова расщепляют трипсином, но не разрушая предварительно дисульфидные связи. Образующиеся фрагменты разделяют электрофорезом и сравнивают с набором фрагментов, полученных при первом расщеплении трипсином. Если между двумя фрагментами есть дисульфидная связь, то при разделении первого набора фрагментов они будут выглядеть на геле как две полосы, а при электрофорезе второго образуют единую полосу{{sfn|Нельсон и Кокс|2017|с=147}}.
| |||