Википедия

CRISPR-Cas13

CRISPR-Cas13 это РНК-нуклеаза которую можно использовать для целенаправленной деградации РНК[1]. Ферменты Cas13 имеют два эндоРНКазных домена HEPN (Higher Eukaryotes and Prokaryotes Nucleotide-binding)[2]. Для нацеливания этот фермент использует направляющую РНК (gRNA). После активации путем спаривания между последовательностью CRISPR РНК (crРНК) и комплементарной одноцепочечной РНК (ssРНК)-мишенью эффектор Cas13 вызывает расщепление РНК-мишени, При этом для активации рибонуклеазы Cas13 требуется почти идеальная комплементарность между целевой РНК и Cas13-ассоциированной направляющей РНК[3]. Поскольку программируемая последовательность направляющей РНК Cas13 примерно в три раза больше, чем исходная последовательность кшРНК, опосредованный CRISPR-Cas13 сайленсинг транскрипции дает исследователям большую избирательность цели. Еще одним преимуществом является то, что Cas13 не требует последовательности PAM (Protospacer adjacent motif— мотив, смежный с протоспейсером), что теоретически позволяет ему нацеливаться практически на любую область РНК[4].

Однако в отличие от белков Argonaute, которые разрезают только комплементарные РНК в цис-положении, Cas13 помимо комплементарных РНК в цис-положении может разрушить и близлежащие некомплементарные РНК в транс-положении, что ограничивает применение некоторых подтипов Cas13 in vivo[5]. Это связано с тем, что нуклеазные домены Cas13 расположены на открытой поверхности белка вдали от кармана связывания crРНК с целевой РНК[3][6].

Однако не все системы CRISPR Cas13 одинаковы, некоторые из них позволяют минимизировать побочные эффекты. Так, высокоточный вариант с мутацией Cas13d-N2V8, названный hfCas13d (high-fidelity Cas13d), демонстрирует активность нокдауна РНК, аналогичную Cas13 дикого типа, но не обнаруживает существенных побочных повреждений у трансгенных мышей[7]. Новый подход к редактированию генов с использованием фермента hfCas13d, нацеленного на РНК, более безопасен, поскольку РНК представляют собой временные молекулы, которые существуют в клетке только в течение короткого периода времени и не интегрируются в геном[8]. Поэтому системы точного редактирования РНК с помощью CRISPR-Cas13 потенциально могут использоваться в терапевтических целях, когда желательно временное изменение функционирования клеток. Так, например, разработаны компактные ферменты Cas13bt-REPAIR, которые можно поместить в аденовирусный вектор AAV и с его помощью редактировать функционально значимые мишени такие как сайты фосфорилирования белков[9]. В частности, путем редактирования кодона в сайте, который способствует деградации бета-катенина при фосфорилировании, удалось в 52-раза увеличить передачу сигналов пути Wnt/бета-катенина, необходимого для стимуляции регенерации печени[9].

Путем слияния каталитически дезактивированного фермента Cas13d с фактором инициации трансляции IF-3 удалось получить программируемый активатор трансляции белков dCasRx-IF3 и с его помощью на посттранскрипционном уровне избирательно усилить синтез определенных белков[10].

Cas12a2 править

Нацеленный на РНК и управляемый РНК фермент Cas12a2 также как Cas13d идентифицирует и расщепляет чужеродную РНК в клетках. Это ограничивает рост зараженных клеток, что позволяет остановить распространение инфекции на другие клетки.[11][12]

Примечания править

  1. ↑ Ashraf, S., Ghouri, M. Z., Javed, M. A., Zafar, H., Ali, H., Qari, S. H., & Ahmad, A. (2022). RNA Editing with CRISPR/Cas13. In The CRISPR/Cas Tool Kit for Genome Editing (pp. 219-254). Springer, Singapore. doi:10.1007/978-981-16-6305-5_7
  2. ↑ Cox, D. B., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Franklin, B., Kellner, M. J., Joung, J., & Zhang, F. (2017). RNA editing with CRISPR-Cas13. Science, 358(6366), 1019-1027. PMID 29070703 PMC 5793859 doi:10.1126/science.aaq0180
  3. ↑ 1 2 Ai, Y., Liang, D., & Wilusz, J. E. (2022). CRISPR/Cas13 effectors have differing extents of off-target effects that limit their utility in eukaryotic cells. Nucleic acids research, 50(11), e65-e65. PMID 35244715 PMC 9226543 doi:10.1093/nar/gkac159
  4. ↑ Goel, K., & Ploski, J. E. (2022). RISC-y Business: Limitations of Short Hairpin RNA-Mediated Gene Silencing in the Brain and a Discussion of CRISPR/Cas-Based Alternatives. Frontiers in Molecular Neuroscience, 15, 914430 PMID 35959108 PMC 9362770 doi:10.3389/fnmol.2022.914430
  5. ↑ Li, Y., Xu, J., Guo, X., Li, Z., Cao, L., Liu, S., ... & You, F. (2022). Collateral cleavage of 28s rRNA by RfxCas13d causes death of mice. bioRxiv. doi:10.1101/2022.01.17.476700
  6. ↑ Li, Z., Li, Z., Cheng, X., Wang, X., Ma, S., Wang, S., ... & Fei, T. (2022). Intrinsic RNA targeting constrains the utility of CRISPR-Cas13 systems. bioRxiv. doi:10.1101/2022.05.14.491940
  7. ↑ Tong, H., Huang, J., Xiao, Q., He, B., Dong, X., Liu, Y., ... & Yang, H. (2022). High-fidelity Cas13 variants for targeted RNA degradation with minimal collateral effects. Nature Biotechnology, 1-12. doi:10.1038/s41587-022-01419-7; (2021). bioRxiv pdf doi:10.1101/2021.12.18.473271
  8. ↑ Researchers allegedly create a new 'controllable, reversible' gene-editing method in China Архивная копия от 20 августа 2022 на Wayback Machine. Cas13 variants with minimal collateral effect are expected to be more competitive for in vivo RNA editing and future therapeutic applications, researchers claim.
  9. ↑ 1 2 Kannan, S., Altae-Tran, H., Jin, X., Madigan, V. J., Oshiro, R., Makarova, K. S., ... & Zhang, F. (2022). Compact RNA editors with small Cas13 proteins. Nature biotechnology, 40(2), 194-197. PMID 34462587 PMC 8929162 doi:10.1038/s41587-021-01030-2
  10. ↑ Otoupal, P. B., Cress, B. F., Doudna, J. A., & Schoeniger, J. S. (2022). CRISPR-RNAa: targeted activation of translation using dCas13 fusions to translation initiation factors. Nucleic Acids Research, 50(15), 8986-8998. PMID 35950485 PMC 9410913 doi:10.1093/nar/gkac680
  11. ↑ Dmytrenko, O., Neumann, G.C., Hallmark, T. et al. (2023). Cas12a2 elicits abortive infection through RNA-triggered destruction of dsDNA. Nature https://doi.org/10.1038/s41586-022-05559-3
  12. ↑ CRISPR-Cas12a2 - A New Kind of Gene Scissors. Дата обращения: 5 января 2023. Архивировано 5 января 2023 года.

Литература править

Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=CRISPR-Cas13&oldid=130888128