Количественный анализ нуклеиновых кислот

Количественный анализ нуклеиновых кислот — определение концентрации ДНК или РНК в смеси или чистом препарате. Реакции с участием нуклеиновых кислот часто требуют точных сведений о количестве и чистоте препарата. Для определения концентрации нуклеиновой кислоты в растворе используют спектрофотометрический метод и УФ-флюоресценцию, если нуклеиновая кислота содержит краситель.

Спектрофотометрический анализПравить

Нуклеиновые кислоты определенным образом поглощают ультрафиолет. В спектрофотометрах образец подвергается действию ультрафиолета с длиной волны 260 нм, а фотодетектор измеряет количество света, прошедшего через образец. Чем больше света поглощено, тем выше концентрация нуклеиновой кислоты в образце.

При помощи закона Бугера — Ламберта — Бера возможно соотнести концентрация молекул, поглощающих излучение с количеством поглощенного света. На длине волны 260 нм средний коэффициент экстинкции для двуцепочечной ДНК составляет 0,020 (мкг/мл)−1 см−1, для одноцепочечной ДНК 0,027 (мкг/мл)−1 см−1, для одноцепочечной РНК 0,025 (мкг/мл)−1 см−1 и для коротких одноцепочечных олигонуклеотидов коэффициент экстинкции зависит от длины и соотношения азотистых оснований (около 0,030 (мкг/мл)−1 см−1). Отсюда, оптическая плотность (англ. OD, optical density) равная 1 соответствует концентрации двуцепочечной ДНК около 50 мкг/мл. Спектрофотометрический способ определения концентрации нуклеиновых кислот применяет при концентрациях до 2 OD.[1] Более точные коэффициенты экстинкции требуются для определения концентрации олигонуклеотидов, и могут быть предсказаны при помощи модели ближайшего соседства.[2]

Коэффициенты пересчетаПравить

Тип нуклеиновой кислоты Концентрация (мкг/мл) для 1 единицы A260
dsDNA (двуцепочечная ДНК) 50
ssDNA (одноцепочечная ДНК) 37
ssRNA (одноцепочечная РНК) 40

Кюветы для анализаПравить

Для определения концентрации образца найденную в стандартной кювете с величиной оптического пути 10 мм оптическую плотность необходимо умножить на соответствующий коэффициент. Например, величина поглощения 0,9 оптических единицы двуцепочечной ДНК соответствует концентрации 45 мкг/мл.

Кюветы малого объемаПравить

Для многих биологических исследований (ДНК-микрочип, количественная ПЦР) требуется качественное и количественное определение малых объемов нуклеиновых кислот. Специальные нанофотометры[3] позволяют определять концентрации образцов без помощи кюветы в субмикролитровых объемах, начиная от 0,3 мкл. Так как производятся измерения неразбавленного образца, воспроизводимость результатов очень высокая, а сами образцы могут быть использованы после анализа.

Чистота образцаПравить

Часто образцы нуклеиновых кислот содержат примеси белков и других органических веществ. Отношение поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (A260/280) часто используют для оценки чистоты препарата. Чистая ДНК имеет соотношение A260/280 порядка 1,8, образец РНК без примесей A260/280 около 2.

Примеси белков и отношение 260:280Править

Для выявления примесей белков в растворах нуклеиновых кислот, анализируют соотношение поглощения растворов на длинах волн 260 и 280 нм, так как ароматические аминокислоты в составе белков поглощают на 280 нм[1][4]. Однако влияние примесных белков на определение концентрации нуклеиновых кислот невелико — лишь при значительной концентрации белка соотношение 260:280 сдвигается существенно[1][5].

Отношение 260:280 позволяет определить примесь нуклеиновых кислот в растворах белков и примесей белков в растворах нуклеиновых кислот:

% белка % нуклеиновой кислоты отношение 260:280
100 0 0,57
95 5 1,06
90 10 1,32
70 30 1,73

Отношение 260:230 имеет меньшую чувствительность при определении примеси белка в растворе нуклеиновой кислоты:

% нуклеиновой кислоты % белка отношение 260:230
100 0 2,00
95 5 1,99
90 10 1,98
70 30 1,94

Такие отличия обусловлены более высоким значением коэффициента молярной экстинкции нуклеиновых кислот на длинах волн 260 и 280 нм в сравнении с белками. Поэтому даже для раствора белка относительно высокой концентрации вклад в поглощение на длинах волн 260 и 280 нм небольшой. Белковое загрязнение в растворе нуклеиновой кислоты не может быть определено по соотношению 260:230.

Другие загрязненияПравить

  • Загрязнения фенолом, который часто используют при выделении нуклеиновых кислот, может приводить к значительным погрешностям при измерении концентрации нуклеиновых кислот. Фенол имеет максимальное поглощение на длине волны 270 нм и соотношение A260/280 около 1,2. Нуклеиновые кислоты, не содержащие фенол, имеют соотношение A260/280 около 2[1]. Примеси фенола могут значительно завысить концентрацию ДНК.
  • Поглощение на длине волны 230 нм может быть вызвано загрязнениями фенолятами, тиоцианатами и другими органическими соединениями. Для чистого образца РНК отношение A260/230 должно быть около 2, для чистого образца ДНК A260/230 около 1,8.[6]
  • Поглощение на длине волны 330 нм и выше указывает на другие загрязнения раствора. Поглощение на этих длинах волн для чистых препаратов нуклеиновых кислот должно быть равно нулю.
  • Отрицательные значения могут быть вызваны неверным выбором раствора, использованного в качестве пустого (blank) либо быть следствием наличия флюоресцентного красителя в растворе.

Определение количества молекул ДНК или РНК с конкретными последовательностями нуклеотидов с помощью технологии SlipChipПравить

Для диагностических целей часто надо определить количество той или иной ДНК или РНК. Разработаны высокочувствительные методы определения ДНК и РНК в микрообъёмах образцов — каплях не превышающих несколько пиколитров. Для этого используются микрожидкостные устройства для ПЦР с одной копии нуклеиновой кислоты[7][8][9][10].

ПримечанияПравить

  1. 1 2 3 4 Sambrook and Russell. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (неопр.). — 3rd. — Cold Spring Harbor Laboratory Press (англ.), 2001. — ISBN 978-087969577-4.
  2. Tataurov A.V.; You Y., Owczarzy R. Predicting ultraviolet spectrum of single stranded and double stranded deoxyribonucleic acids (англ.) // Biophys. Chem. : journal. — 2008. — Vol. 133, no. 1—3. — P. 66—70. — doi:10.1016/j.bpc.2007.12.004. — PMID 18201813.
  3. Kartha, R. Spectrophotometric Quantification of Nano- and Standard-Volume Samples, (2008, October 7), American Biotechnology Laboratory, http://www.iscpubs.com/Media/PublishingTitles/b0608kar.pdf
  4. Sambrook and Russell cites the original paper: Warburg, O. and Christian W. Isolierung und Kristallisation des Gärungsferments Enolase (нем.) // Biochem. Z. (англ.) : magazin. — 1942. — Bd. 310. — S. 384—421.)
  5. Glasel J. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios (англ.) // BioTechniques (англ.) : journal. — 1995. — Vol. 18, no. 1. — P. 62—63. — PMID 7702855.)
  6. The Analysis of DNA or RNA using Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com (13 января 2010). Дата обращения: 12 марта 2010. Архивировано 6 сентября 2012 года.
  7. Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., & Ismagilov, R. F. (2010). Digital PCR on a SlipChip]. Lab on a Chip, 10(20), 2666—2672. doi:10.1039/c004521g PMC 2948063
  8. Jesus Rodriguez-Manzano, Mikhail A. Karymov, Stefano Begolo, David A. Selck, Dmitriy V. Zhukov, Erik Jue, Rustem F. Ismagilov. Reading Out Single-Molecule Digital RNA and DNA Isothermal Amplification in Nanoliter Volumes with Unmodified Camera Phones. ACS Nano, 2016; doi:10.1021/acsnano.5b0733
  9. Ahrberg, C. D., Ilic, B. R., Manz, A., & Neužil, P. (2016). Handheld real-time PCR device.Lab on a Chip., 16, 586—592 doi:10.1039/C5LC01415H PMID 26753557 PMC 4773913Available on 2017-01-26
  10. Zhao Li, Yong Liu, Qingquan Wei, Yuanjie Liu, Wenwen Liu, Xuelian Zhang, and Yude Yu1 (2016). Picoliter Well Array Chip-Based Digital Recombinase Polymerase Amplification for Absolute Quantification of Nucleic Acids. PLoS One.; 11(4): e0153359 doi:10.1371/journal.pone.0153359 PMC 4830604