Метод ДНК-комет

Метод ДНК-комет — это метод регистрации повреждения ДНК и изучения репарации на уровне одиночных клеток. Метод способен выявлять разрывы нитей ДНК в отдельных клетках. Является быстрым и весьма чувствительным.

Внешний вид и ранжирование ДНК-комет:

Пять условных типов ДНК-комет, которые учитываются при анализе степени поврежденности ДНК

История

Первым успешным опытом исследования поврежденности ДНК индивидуальных клеток принято считать работу Rydberg и Johanson (1978 г.). Впоследствии метод неоднократно модифицировался и усовершенствовался с целью его упрощения и повышения чувствительности выявления повреждений клеточной ДНК.

Применимость

Метод ДНК-комет применим в системах in vivo и in vitro. В настоящее время метод широко используется в исследованиях генотоксичности ионизирующего излучения, фармацевтических препаратов и промышленных химических веществ, репарации ДНК, апоптоза, клинических исследованиях по пренатальной диагностике, предрасположенности к онкологическим заболеваниям, терапии при раке, катаракте. Данный метод постепенно становится неотъемлемой частью программ по биомониторингу:

• оценке влияния пищевого рациона, факторов внешней среды, изменений метаболизма и физиологического состояния, старения организма на накопление и репарацию повреждений ДНК;
• по изучению механизмов радиопротекторных воздействий, формирования радиоадаптивного ответа;
• исследований по экологии.

Использование метода позволяет учитывать гетерогенность сложных популяций, изучать выход повреждений ДНК и репарацию практически в любых эукариотических клетках. При этом для анализа необходимо всего несколько тысяч клеток исследуемого образца.

Постановка метода

Проводится иммобилизация подвергнутых воздействию изучаемого фактора клеток в низкоплавкой агарозе, нанесенной на предметное стекло для микроскопии. Обработка образцов в буфере с высоким содержанием соли приводит к лизису клеточных мембран и экстракции белков. Молекулы ДНК разделяют электрофорезом, треки ДНК визуализируют посредством окрашивания флуоресцентным красителем, после чего образцы изучают микроскопически. При наличии разрывов ДНК нарушается структурная организация хроматина и утрачивается сверхспирализация ДНК, что приводит к релаксации этой биомакромолекулы, формируются фрагменты ДНК, не связанные с клеткой. В электрическом поле релаксированные петли и фрагменты ДНК вытягиваются по направлению к аноду, что и придает наблюдаемым объектам вид «комет» (отсюда и произошло название «comet assay», ставшее общеупотребительным). Количество ДНК, мигрировавшей по направлению к аноду и определяемое микрофотометром, может использоваться в качестве показателя, характеризующего уровень повреждений ДНК в изучаемых клетках. «Кометы» анализируют либо путём визуального наблюдения и дифференциации «комет» по степени поврежденности ДНК, либо с использованием компьютерных программных средств обработки изображений. Последний метод анализа «комет» особенно необходим для объективной оценки влияния небольшой концентрации повреждающего агента, или для выявления незначительных различий между субпопуляциями клеток.

Стандартизация метода

В настоящее время большинство лабораторий, внедривших данный методологический подход в исследования, разработали многочисленные вариации протокола, в частности продолжительности и условий лизиса клеток, денатурации, электрофореза и окрашивания ДНК. Подсчитывают 25-500 клеток на одном стекле в двух повторах. Результаты эксперимента являются достоверными при повторении не менее 6 раз. Анализ ДНК-комет может проводиться визуально или с помощью программно-аппаратного комплекса. При визуальном анализе ДНК-кометы ранжируют на пять условных типов с соответствующим числовым значением от 0 до 4.

Расчет индексов

Обозначение	Характеристика	Расчёт
${\mathsf {\mbox{I}}}_{\mbox{dc}}$	Индекс ДНК-comet (index of DNA comet) ${\mathsf {\mbox{I}}}_{\mbox{dc}}$ — Степень поврежденности ДНК Индекс ДНК-комет — рассчитывается как отношение суммы «ДНК—комет» каждого типа, к общей сумме подсчитанных «ДНК-комет».	${\mathsf {\mbox{I}}}_{\mbox{dc}}={\frac {(0{\mbox{n}}_{0}+1{\mbox{n}}_{1}+2{\mbox{n}}_{2}+3{\mbox{n}}_{3}+4{\mbox{n}}_{4})}{\Sigma }}$ , где ${{\mbox{n}}_{0}-{\mbox{n}}_{4}}$ — число «ДНК-комет» каждого типа, а ${\Sigma }$ — сумма подсчитанных «ДНК-комет».

Программы для работы с изображением и анализа

• CometScore — бесплатная программа для полуавтоматических расчетов показателей ДНК-комет, совместима с Windows 5 и 6.
• CaspLab — GPL software.
• Коммерческая программа — listed by Comet Assay Interest Group

См. также

• Метафазный анализ
• Ана-телофазный анализ
  • Allium test

Литература

• Длительное воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды сопровождается накоплением повреждений ДНК и изменением активности системы репарации, что может привести к возникновению мутаций и злокачественной трансформации клетки. В последние годы было разработано много методов, позволяющих регистрировать повреждения ДНК, а также исследовать процессы репарации. Однако не все они обладают достаточной чувствительностью и специфичностью, необходимой для мониторинга широкого спектра повреждений ДНК, вызванных факторами окружающей среды. Цель обзора состоит в оценке эффективности метода гельэлектрофореза лизированных единичных клеток (метод ДНК-комет) для детекции повреждений ДНК, вызванных различными агентами окружающей среды. Метод обладает чувствительностью, необходимой для регистрации повреждений и репарации ДНК на уровне отдельной клетки, и может быть применен для оценки интегральной целостности генома.
• У.Б. Сорочинска, В.М. Михайленк. Применение метода ДНК-комет для оценки поврежденией ДНК, вызванных различными агентами окружающей среды (рус.) // ОНКОЛОГИЯ : Статья. — Киев, 2008. — Т. 10, вып. 3. — С. 303—309. Архивировано 5 марта 2016 года.
• Avishai, Nanthawan; Rabinowitz, Claudette; Moiseeva, Elisabeth & Rinkevich, Baruch. Genotoxicity of the Kishon River: the application of an in vitro cellular assay : HTML abstract. — Israel: Mutation Research, 2002. — Т. 1, вып. 518. — С. 21–37. — doi:10.1016/S1383-5718(02)00069-4.
• Collins, A.R.; Dobson, V.L.; Dusinska, M.; Kennedy, G. & Stetina, R. The comet assay: what can it really tell us? // Mutation Research : HTML abstract. — 1997. — Т. 2, вып. 375. — С. 183—193. — doi:10.1016/S0027-5107(97)00013-4.
• Klaude, M.; Eriksson, S.; Nygren, J. & Ahnstrom, G. The comet assay: mechanisms and technical considerations. — Mutation Research, 1996. — Т. 2, вып. 363. — С. 89—96. — doi:10.1016/0921-8777(95)00063-1.
• McKelvey-Martin, Valerie J.; Ho, Edwin T.; McKeown, Stephanie R.; Johnston, S. Robin; McCarthy, Patsy J.; Rajab, Nor Fasilah & Downes, C. Stephen. Emerging applications of the single cell gel electrophoresis (Comet) assay. I. Management of invasive transitional cell human bladder carcinoma. II. Fluorescent in situ hybridization Comets for the identification of damaged and repaired DNA sequences in individual cells : PDF fulltext. — Mutagenesis, 1993. — Т. 1, вып. 13. — С. 1—8. — doi:10.1016/0921-8777(95)00063-1.
• Olive, P.L.; Wlodek, D. & Banath, J.P. DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis // Cancer Research : PDF fulltext. — 1991. — Т. 17, вып. 51. — С. 4671—4676.
• Rojas, E.; Lopez, M.C. & Valverde, M. Single cell gel electrophoresis: methodology and applications // Journal of Chromatography B : HTML abstract. — 1999. — Т. 722(1-2). — С. 225—254. — doi:10.1016/S0378-4347(98)00313-2.
• Singh, N.P.; McCoy, M.T.; Tice, R.R. & Schneider, E.L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells // Experimental Cell Research. — 1988. — Т. 175(1). — С. 184—191. — doi:10.1016/0014-4827(88)90265-0.