STED-микроскопия

STED-микроскопия (англ. Stimulated Emission Depletion Microscopy — микроскопия на основе подавления спонтанного испускания) — разновидность флюоресцентной микроскопии, достигающая разрешения сверх дифракционного предела путём избирательного тушения флюоресценции^[1]. Метод был разработан Штефаном Хеллем в 1994 году^[2] и продемонстрирован в 1999 году. Удостоен Нобелевской премии по Химии в 2014 г.^[3]

В 1986 г. В. А. Охонин (Институт Биофизики CO АН СССР) запатентовал идею STED-микроскопа^[4]. Этот патент был, по-видимому, неизвестен Хеллю и Вихману в 1994.

Принцип метода

Накачка (1) переводит систему в возбуждённое состояние. Флуоресценция (2) подавляется конкурирующим стимулированным испусканием (3)

При обычной конфокальной люминесцентной микроскопии исследуемое вещество оптически возбуждается, и его флюоресценция регистрируется приёмником. Пространственное разрешение метода ограничено дифракционным пределом порядка

D={\frac {\lambda }{NA}},

где $\lambda$ — длина волны, а $NA$ — апертура.

Для его преодоления в STED-микроскопии используется второй лазер с бо́льшей длиной волны для стимулирования излучательных переходов в веществе по краям фокусного пятна. При облучении кольцевым лазером происходит принудительное испускание перехода с возбуждённого уровня на некоторый вибрационный уровень. Таким образом, на краях пятна происходит обеднение населённости возбуждённого уровня, и люминесценция на длине волны $\lambda$ подавляется, позволяя достичь лучшего разрешения в центральной области.

Сравнение обычной конфокальной микроскопии (слева), и STED-микроскопии (центр) на примере репликативных фабрик ДНК. Справа показано наложение двух методов. Черно-белые врезки ниже иллюстрируют, что разрешение STED-микроскопии выше.

Пятно основного возбуждения (слева), кольцевое пятно стимулированного излучения (центр), область флюоресцирующего вещества (справа).

Примечания

↑ Westphal, V.; S. O. Rizzoli, M. A. Lauterbach, D. Kamin, R. Jahn, S. W. Hell (2008). Science 320: 246—249.
↑ S. W. Hell, J. Wichmann (1994). Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: Stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters 19 (11): 780–782.
↑ S.W. Hell, Nanoscopy with Focused Light Архивная копия от 11 апреля 2015 на Wayback Machine, Nobel Lecture in Chemistry, 08.12.2014.
↑ Охонин В. А., Институт биофизики СО АН СССР, Способ исследования микроструктуры образца Архивная копия от 11 апреля 2015 на Wayback Machine, Номер патента: 1374922, Приоритет от 10.04.1986, Опубликовано: 30.07.1991, База патентов СССР. Цитируется в патентах США: US 5394268 A Архивная копия от 13 февраля 2015 на Wayback Machine (1993) and US RE38307 E1 Архивная копия от 12 февраля 2015 на Wayback Machine (1995). Из описания изобретения: "Сущность изобретения заключается в том, что возбуждают люминесценцию образца, помещенного в поле нескольких стоячих световых волн, вызывающих тушение люминесценции из-за вынужденных переходов из люминесцирующего состояния в короткоживущие состояния всюду, кроме малых окрестностей точек, в которых вызывающая переходы в короткоживущее состояние компонента поля (вынуждающая компонента поля) стоячих волн обращается и ноль."

Ссылки

Overview at the Department of NanoBiophotonics at the Max Planck Institute for Biophysical Chemistry.
Brief summary of the RESOLFT equations developed by Stefan Hell.

[1] Westphal, V.; S. O. Rizzoli, M. A. Lauterbach, D. Kamin, R. Jahn, S. W. Hell (2008). Science 320: 246—249.

[2] S. W. Hell, J. Wichmann (1994). Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: Stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters 19 (11): 780–782.

[3] S.W. Hell, Nanoscopy with Focused Light Архивная копия от 11 апреля 2015 на Wayback Machine, Nobel Lecture in Chemistry, 08.12.2014.

[4] Охонин В. А., Институт биофизики СО АН СССР, Способ исследования микроструктуры образца Архивная копия от 11 апреля 2015 на Wayback Machine, Номер патента: 1374922, Приоритет от 10.04.1986, Опубликовано: 30.07.1991, База патентов СССР. Цитируется в патентах США: US 5394268 A Архивная копия от 13 февраля 2015 на Wayback Machine (1993) and US RE38307 E1 Архивная копия от 12 февраля 2015 на Wayback Machine (1995). Из описания изобретения: "Сущность изобретения заключается в том, что возбуждают люминесценцию образца, помещенного в поле нескольких стоячих световых волн, вызывающих тушение люминесценции из-за вынужденных переходов из люминесцирующего состояния в короткоживущие состояния всюду, кроме малых окрестностей точек, в которых вызывающая переходы в короткоживущее состояние компонента поля (вынуждающая компонента поля) стоячих волн обращается и ноль."

[1]

[2]

[3]

[4]