STED-микроскопия (англ. Stimulated Emission Depletion Microscopy — микроскопия на основе подавления спонтанного испускания) — разновидность флюоресцентной микроскопии, достигающая разрешения сверх дифракционного предела путём избирательного тушения флюоресценции[1]. Метод был разработан Штефаном Хеллем в 1994 году[2] и продемонстрирован в 1999 году. Удостоен Нобелевской премии по Химии в 2014 г.[3]

В 1986 г. В. А. Охонин (Институт Биофизики CO АН СССР) запатентовал идею STED-микроскопа[4]. Этот патент был, по-видимому, неизвестен Хеллю и Вихману в 1994.

Принцип метода

править
 
Накачка (1) переводит систему в возбуждённое состояние. Флуоресценция (2) подавляется конкурирующим стимулированным испусканием (3)

При обычной конфокальной люминесцентной микроскопии исследуемое вещество оптически возбуждается, и его флюоресценция регистрируется приёмником. Пространственное разрешение метода ограничено дифракционным пределом порядка

 

где   — длина волны, а   — апертура.

Для его преодоления в STED-микроскопии используется второй лазер с бо́льшей длиной волны для стимулирования излучательных переходов в веществе по краям фокусного пятна. При облучении кольцевым лазером происходит принудительное испускание перехода с возбуждённого уровня на некоторый вибрационный уровень. Таким образом, на краях пятна происходит обеднение населённости возбуждённого уровня, и люминесценция на длине волны   подавляется, позволяя достичь лучшего разрешения в центральной области.

 
Сравнение обычной конфокальной микроскопии (слева), и STED-микроскопии (центр) на примере репликативных фабрик ДНК. Справа показано наложение двух методов. Черно-белые врезки ниже иллюстрируют, что разрешение STED-микроскопии выше.
 
Пятно основного возбуждения (слева), кольцевое пятно стимулированного излучения (центр), область флюоресцирующего вещества (справа).

Примечания

править
  1. Westphal, V.; S. O. Rizzoli, M. A. Lauterbach, D. Kamin, R. Jahn, S. W. Hell (2008). Science 320: 246—249.
  2. S. W. Hell, J. Wichmann (1994). Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: Stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters 19 (11): 780–782.
  3. S.W. Hell, Nanoscopy with Focused Light Архивная копия от 11 апреля 2015 на Wayback Machine, Nobel Lecture in Chemistry, 08.12.2014.
  4. Охонин В. А., Институт биофизики СО АН СССР, Способ исследования микроструктуры образца Архивная копия от 11 апреля 2015 на Wayback Machine, Номер патента: 1374922, Приоритет от 10.04.1986, Опубликовано: 30.07.1991, База патентов СССР. Цитируется в патентах США: US 5394268 A Архивная копия от 13 февраля 2015 на Wayback Machine (1993) and US RE38307 E1 Архивная копия от 12 февраля 2015 на Wayback Machine (1995). Из описания изобретения: "Сущность изобретения заключается в том, что возбуждают люминесценцию образца, помещенного в поле нескольких стоячих световых волн, вызывающих тушение люминесценции из-за вынужденных переходов из люминесцирующего состояния в короткоживущие состояния всюду, кроме малых окрестностей точек, в которых вызывающая переходы в короткоживущее состояние компонента поля (вынуждающая компонента поля) стоячих волн обращается и ноль."

Ссылки

править