ДНК-маркер
ДНК-ма́ркеры, или молекулярно-генетические маркеры — полиморфный признак, выявляемый методами молекулярной биологии на уровне нуклеотидной последовательности ДНК для определённого гена или для любого другого участка хромосомы при сравнении генотипов различных особей, пород, сортов, линий.
![](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/4/42/9900_IRAP.jpg/220px-9900_IRAP.jpg)
![](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/2a/Retroelements_markers_principle.jpg/220px-Retroelements_markers_principle.jpg)
За последние годы накопилось много данных об эффективности использования молекулярно-генетических маркеров на уровне как белков, так и ДНК, РНК, для решения многих задач генетики, селекции, сохранения биоразнообразия, изучения механизмов эволюции, картирования хромосом, а также для семеноводства и племенного дела.
Наиболее широко используемые молекулярно-генетические маркеры условно можно подразделить на следующие типы — маркеры участков структурных генов, кодирующих аминокислотные последовательности белков (электрофоретические варианты белков), маркеры некодирующих участков структурных генов и маркеры различных последовательностей ДНК, отношение которых к структурным генам, как правило, неизвестно — распределение коротких повторов по геному (RAPD — случайно амплифицируемая полиморфная ДНК; ISSR — инвертированные повторы; AFLP — полиморфизм в сайтах рестрикции) и микросателлитные локусы (тандемные повторы с длиной элементарной единицы в 2-6 нуклеотидов).
Имеется целый набор современных технологий выявления полиморфизма на уровне ДНК, среди которых можно выделить следующие:
- анализ полиморфизма длин рестриктных фрагментов ДНК (RFLP);
- анализ полиморфизма с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и другие методы на основе амплификации ДНК между повторяющимися последовательностями в геномной ДНК.
Маркеры на основе ДНК-зондов
править- RFLP (ПДРФ-маркеры, от «полиморфизм длин рестрикционных фрагментов»). Оценка полиморфизма длин рестриктных фрагментов ДНК может быть осуществлена разными способами, но наиболее традиционен метод с использованием блот-гибридизации)[1]. Этот метод включает в себя выделение ДНК, получение фрагментов рестрикции, их электрофоретическое разделение, перенос на фильтры с последующей гибридизацией специфических ДНК-зондов с полученными фрагментами ДНК. ДНК-зонд — относительно короткая последовательность клонированной ДНК с определённым уровнем гомологии и способностью гибридизоваться с соответствующим участком геномной ДНК. Комбинации рестриктаз и зондов дают высоко-воспроизводимые полиморфные спектры фрагментов ДНК, специфичные для каждого индивидуума. Различия между последними могут быть обусловлены, например, мутациями, меняющими сайт рестрикции. ПДРФ имеет ряд важных преимуществ, в числе которых высокая воспроизводимость спектров в разных лабораториях, кодоминантное «поведение» маркера. ПДРФ эффективен при картировании генома, маркировании генов многих биологических и экономически важных признаков.
- VNTR (англ. Variable Number Tandem Repeat) — метод, получивший название ДНК-фингерпринта («отпечатки пальцев»)[2]. Тандемные повторы широко распространены в разных геномах и высокополиморфны. В результате высокой вариабельности этих участков ДНК ПДРФ-анализ с зондами к микро- и минисателлитным последовательностям позволяет получать мультилокусные спектры с высоким разрешением на популяционном уровне. Благодаря очень высокому уровню полиморфизма этот подход в настоящее время является хорошим инструментом для анализа внутри- и межпопуляционной изменчивости и определения генетических расстояний между группами организмов. VNTR-аллельные варианты имеют кодоминантный характер наследования.
ПЦР-маркеры
правитьМетод полимеразной цепной реакции (ПЦР) предполагает использование специфических праймеров и получение дискретных ДНК-продуктов амплификации отдельных участков геномной ДНК. Большое количество родственных технологий построено на этом принципе. Наиболее широко используемая технология RAPD основана на анализе амплифицированных полиморфных фрагментов ДНК с помощью единичных праймеров с произвольной нуклеотидной последовательностью[3],[4],[5].
- SSR (англ. Simple Sequence Repeats) — ПЦР с флангирующими праймерами к короткому мини- или микросателлитному повтору позволяет выявлять маркеры с кодоминантным наследованием и, соответственно, удобен для выявления гетерозигот по данному локусу. Однако одна пара праймеров для флангов в ПЦР позволяет рассматривать полиморфизм только одного локуса. Для многих микросателлитных локусов не удается выявить полиморфизм. Как правило, фланкирующие последовательности для данного микросателлитного локуса оказываются видоспецифичными.
- RAPD (англ. Random Amplified Polymorphic DNA) — полимеразная цепная реакция с использованием единичного короткого (обычно 10-членного) праймера с произвольной нуклеотидной последовательностью[6],[7]. Последовательность праймеров не абсолютно любая, а ограничена значениями GC-состава 40-70 % и лингвистической сложности нуклеотидной последовательности 50-100 %. В RAPD можно использовать как одиночный праймер, так и несколько RAPD-праймеров. Продукт RAPD образуется в результате амплификации фрагмента геномной ДНК, фланкированной инвертированной последовательностью используемого праймера. Метод универсален для исследований разных видов, при использовании одних и те же праймеров. Как правило, праймер, выявляющий высокий полиморфизм для одного вида, будет эффективен и для других видов.
- ISSR (англ. Inter Simple Sequence Repeats)[8][9] — специализированный вариант метода RAPD, в котором праймер состоит из микросателлитной последовательности. В этом методе, как и в RAPD, используется один или несколько праймеров длиной в 15-24 нуклеотида. Но в данном случае праймеры состоят из тандемных коротких 2-4 нуклеотидных повторов, например, 5’-CA CA CA CA CA CA CA CA CA G, и одного или двух селективных нуклеотидов на 3’-конце праймера. Продукты ISSR-амплификации содержат на флангах инвертированную микросателлитную последовательность праймера. Так как в данном методе последовательность праймеров специфична и подбирается более строго, чем в RAPD, отжиг в ПЦР можно проводить при более высокой температуре (55-60°С), чем для метода RAPD, а поэтому фингерпринт обычно лучше воспроизводим.
- AFLP (англ. Amplified Fragment Length Polymorphism)[10] — технология, представляющая собой комбинацию методов ПДРФ и ПЦР. AFLP — сложный метод, состоящий из нескольких этапов: геномная ДНК одновременно рестрицируется двумя рестриктазами (EcoRI и MseI), узнающими 4 и 6 оснований соответственно, получая фрагменты с выступающими 3’-концами. Затем рестрицированная геномная ДНК лигируется с адаптором, содержащим «липкие» концы для рестрикционных сайтов (EcoRI и MseI). После этого проводится две последовательные ПЦР. В первой ПЦР (преамплификация) используются праймеры, полностью комплементарные адапторам EcoRI и MseI. После первой ПЦР образуется большое количество продуктов амплификации между адапторами EcoRI и MseI, которые трудно дифференцировать с помощью электрофореза. Поэтому во второй ПЦР праймеры с адапторами EcoRI и MseI содержат на 3’-конце дополнительные и не комплементарные адапторам от 1 до 3 основания, для селективной амплификации. Разделение фрагментов ДНК выполняется в полиакриламидном геле, с радиоактивной или флюоресцентной меткой соответственно.
- SSAP (англ. Sequence Specific Amplification Polymorphism)[11] явился модификацией метода AFLP для выявления полиморфизма как по сайту рестрикции, так и по вставки[прояснить] в геномную ДНК транспозона или ретротранспозона. Геномная ДНК исследуемых образцов расщепляется рестриктазами PstI и MseI, и получаются фрагменты с выступающими 3’-концами. Затем рестрицированная ДНК лигируется с адапторами PstI и MseI. Первая полимеразная цепная реакция (преамплификация) проводится с праймерами от адапторов PstI и МseI, то есть амплифицируются все возможные комбинации сочетания этих адапторов в рестрицированной геномной ДНК. После первой ПЦР образуется большое количество продуктов амплификации фрагментов ДНК, локализованных между праймерами и адапторами. Продукты ПЦР разбавляются и используются для второй, селективной ПЦР. Вторая ПЦР проводится с меченным праймером к LTR и любым праймером адапторов, либо с PstI или MseI. Во второй ПЦР можно использовать праймеры к адаптору с дополнительными нуклеотидами на 3'-конце, например, один, два или три нуклеотида, не комплементарные адаптору. Электрофорез после второй ПЦР проводят в полиакриламидном геле или в секвенаторе, если использовалась флюоресцентная метка. Продукты амплификации после второй ПЦР образуются в результате амплификации фрагмента ДНК между последовательностью LTR ретротранспозона и адаптором. Получение продуктов амплификации между только последовательностями LTR принципиально возможно, но, как правило, расстояние между двумя ретротранспозонами длиннее обычно получаемых размеров продуктов ПЦР (2500 — 3000 пар оснований). А продукты амплификации между адапторами не будут выявляться, поскольку используется метка только для праймера LTR.
- IRAP Архивная копия от 30 октября 2016 на Wayback Machine (англ. Inter Retrotransposone Amplified Polymorphism)[12][13] — полимеразная цепная реакция между праймерами, комплементарными последовательностям двух рядом расположенных LTR ретротранспозона. Метод имеет несколько вариантов. В первом варианте IRAP используется единичный праймер из LTR. Продукты амплификации образуются между двумя инвертированными LTR с одинаковой последовательностью, то есть в одной цепи 5’-конец одного LTR ориентирован к 3’-концу другого LTR. Если центральная часть ретротранспозона длиннее обычного размера продуктов ПЦР (около 3000 пар оснований), то ПЦР будет проходить только между двумя LTR из разных ретротранспозиций. В этом случае соседние LTR должны располагаться в инвертированном положении. В другом варианте IRAP используются два разных праймера к инвертированным LTR: один праймер с 5’-конца, а другой с 3’-конца LTR, ориентированные в разные стороны от ретротранспозона. В данном случае соседние LTR располагаются как прямые длинные повторы. И, наконец, в третьем варианте IRAP используются праймеры к LTR из разных ретротрапозонов в различной ориентации. Можно комбинировать праймеры из LTR с другими праймерами из повторяющейся ДНК.
- REMAP (англ. Retrotransposone Microsatellite Amplified Polymorphism)[12][13] — полимеразная цепная реакция между праймером к фрагменту LTR ретротранспозона и праймером из рядом расположенного, простого микросателлитного повтора (ISSR-праймер). В данном случае позиция амплифицируемого фрагмента ретротранспозона «заякоривается» путём использования праймера к микросателлитному локусу. Например, у растений удобным оказывается использование праймера к LTR и праймера к микросателлиту (5’-CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA G) c единичным селективным нуклеотидом на 3’-конце праймера. В REMAP применяют варианты LTR-праймеров как для 5’-конца, так и для 3’-конца LTR, как и в IRAP.
- RBIP (англ. Retrotransposon-Based Insertion Polymorphisms)[14] — метод, основанный на использовании праймеров к последовательностям ретротранспозонов и выявляющий кодоминантные аллельные варианты. Его принцип основан на мультилокусной ПЦР, в которой используются пара праймеров, фланкирующих участок ДНК до ретротранспозиции и праймер к LTR ретротранспозона, который встроен в данный участок между первыми двумя праймерами. В результате ПЦР будет амлифицироваться один из вариантов фрагментов, фланкированных парой праймеров, поскольку последовательность между LTR слишком длинная для ПЦР между сайтами геномной ДНК с ретротранспозоном внутри. Этот метод выявляет полиморфизм только для данного полиморфного локуса. К его достоинствам относят кодоминантность полиморфных вариантов, возможность использования для дот-блот-анализа большого количества сортов.
- iPBS (англ. inter PBS amplification)[15] — метод, основанный на использовании праймеров к последовательностям ретротранспозонов PBS (англ. Primer binding site, участок связывания тРНК). Метод эффективен для выявления полиморфизма между образцами, а также для клонирования новых ретротранспозонов у эукариот.
- Однонуклеотидный полиморфизм (SNP).
Примечания
править- ↑ Southern E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis (англ.) // J Mol Biol[англ.] : journal. — 1974. — Vol. 98, no. 3. — P. 503—517. — doi:10.1016/S0022-2836(75)80083-0.
- ↑ Jeffreys A. J., Wilson V., Thein S. W. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA (англ.) // Nature. — 1984. — Vol. 314. — P. 67—73. — doi:10.1038/314067a0.
- ↑ Kalendar R. The use of retrotransposon-based molecular markers to analyze genetic diversity (англ.) // Field and Vegetable Crops Research : journal. — 2011. — Vol. 48, no. 2. — P. 261—274. — doi:10.5937/ratpov1102261K. Архивировано 6 июля 2017 года.
- ↑ Kalendar R., Flavell A., Ellis THN, Sjakste T., Moisy C., Schulman A. H. Analysis of plant diversity with retrotransposon-based molecular markers (англ.) // Heredity : journal. — 2011. — Vol. 106. — P. 520—530. — doi:10.1038/hdy.2010.93. Архивировано 6 июля 2017 года.
- ↑ Календарь Р.Н., Глазко В.И. Типы молекулярно-генетических маркеров и их применение // Физиология и биохимия культурных растений : журнал. — 2002. — Т. 34, № 4. — С. 141—156. (недоступная ссылка)
- ↑ Williams J. G., Kubelik A. R., Livak K. J., Rafalski J. A., Tingey S. V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers (англ.) // Nucleic Acids Research[англ.] : journal. — 1990. — Vol. 18, no. 22. — P. 6531—6535. — doi:10.1093/nar/18.22.6531.
- ↑ Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers (англ.) // Nucleic Acids Research[англ.] : journal. — 1990. — Vol. 18. — P. 7213—7218. — doi:10.1093/nar/18.24.7213.
- ↑ Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н., Чеботарь С.В. Генетический полиморфизм злаковых растений при помощи ПЦР с произвольными праймерами // Цитология и Генетика : журнал. — 1994. — Т. 28. — С. 54—61. Архивировано 4 марта 2016 года.
- ↑ Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification (англ.) // Genomics : journal. — Academic Press, 1994. — Vol. 20, no. 2. — P. 176—183. — doi:10.1006/geno.1994.1151.
- ↑ Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting (англ.) // Nucleic Acids Research[англ.] : journal. — 1995. — Vol. 23. — P. 4407—4414. — doi:10.1093/nar/23.21.4407.
- ↑ Waugh R., McLean K., Flavell A. J., Pearce S. R., Kumar A., Thomas B. B., Powell W. Genetic distribution of Bare-1-like retrotransposable elements in the barley genome revealed by sequence-specific amplification polymorphisms (S-SAP) (англ.) // Molecular General Genetics : journal. — 1997. — Vol. 253, no. 6. — P. 687—694. — doi:10.1007/s004380050372.
- ↑ 1 2 Kalendar R., Grob T., Regina M., Suoniemi A., Schulman A. H. IRAP and REMAP: Two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques (англ.) // Theoretical and Applied Genetics[англ.] : journal. — 1999. — Vol. 98. — P. 704—711. — doi:10.1007/s001220051124. Архивировано 4 марта 2016 года.
- ↑ 1 2 Kalendar R., Schulman A. H. IRAP and REMAP for retrotransposon-based genotyping and fingerprinting (англ.) // Nature Protocols[англ.] : journal. — 2006. — Vol. 1, no. 5. — P. 2478—2484. — doi:10.1038/nprot.2006.377. Архивировано 9 ноября 2016 года.
- ↑ Flavell A. J., Knox M. R., Pearce S. R., Ellis THN. Retrotransposon-based insertion polymorphisms (RBIP) for high throughput marker analysis (англ.) // The Plant Journal[англ.] : journal. — 1998. — Vol. 16, no. 5. — P. 643—650. — doi:10.1046/j.1365-313x.1998.00334.x.
- ↑ Kalendar R., Antonius K., Smykal P., Schulman A. H. iPBS: A universal method for DNA fingerprinting and retrotransposon isolation (англ.) // Theoretical and Applied Genetics[англ.] : journal. — 2010. — Vol. 121, no. 8. — P. 1419—1430. — doi:10.1007/s00122-010-1398-2. Архивировано 9 ноября 2016 года.