Эндонуклеазы рестрикции

(перенаправлено с «Рестриктазы»)

Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы (от лат. restrictio — ограничение, следует отказаться от термина "рестриктаза", как вульгаризованного) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот.

В отличие от экзонуклеаз, эндонуклеазы рестрикции расщепляют нуклеиновые кислоты не с конца молекулы, а в середине. При этом каждый такой фермент узнаёт определённый участок ДНК (сайт) длиной от четырёх пар нуклеотидов (возможно вырождение) и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его.

Защита бактериального генома от собственной эндонуклеазы рестрикции осуществляется, как правило, с помощью метилирования нуклеотидных остатков аденина и цитозина (маскирования)[1].

При проведении дайджеста в неоптимальных условиях (особенно при превышении концентрации фермента) эндонуклеазы проявляют звёздчатую активность (снижение специфичности рестрикции).

Классификация

править

Выделяют три основных типа (или класса) ферментов рестрикции, сайты узнавания для которых могут быть симметричными (палиндромными) и несимметричными[2]:

  • Эндонуклеазы рестрикции первого типа (например, ЕсоК из Escherichia coli К12) узнают определённую последовательность нуклеотидов и разрезают двуцепочную молекулу ДНК неподалёку от этой последовательности в произвольной точке, и само место разреза не строго специально (по-видимому, после образования комплекса с ДНК фермент неспецифически взаимодействует с удалённой областью ДНК или передвигается вдоль цепи ДНК). Обладают рестриктазной, метилазной и АТФазной активностями.
  • Эндонуклеазы рестрикции второго типа (например, EcoRI, XbaI) узнают определённую последовательность и разрезают двойную цепь ДНК в определённой фиксированной точке внутри этой последовательности. Эндонуклеазы рестрикции этого типа узнают палиндромные последовательности, которые обладают центральной осью и считываются одинаково в обе стороны от оси симметрии. Не обладают АТФазной активностью.
  • Эндонуклеазы рестрикции третьего промежуточного типа (например, EcoPI) узнают нужную последовательность и разрезают двуцепочную молекулу ДНК, отступив определённое число нуклеотидных пар от её конца (или в нескольких точках на разном удалении от сайта узнавания). При этом образуются фрагменты ДНК либо с ровными (тупыми) концами, либо с выступающими (липкими) 5'- или 3'-концами. Эти эндонуклеазы рестрикции узнают асимметричные сайты. Эти их свойства широко используются в различных методах сборки ДНК in vitro, как, например, сборка Golden Gate. Эти эндонуклеазы рестрикции обладают рестриктазной,метилазной и АТФ-азной активностями

К 2007 году выделено более трёх тысяч эндонуклеаз рестрикции.[3] Более шестисот эндонуклеаз рестрикции доступны в виде коммерческих препаратов и повседневно используются в лабораториях для модификации ДНК и решения генно-инженерных задач.[4][5][6]

Номенклатура рестриктаз

править

С момента их открытия в 1970-х годах было идентифицировано множество ферментов рестрикции; например, охарактеризовано более 3500 различных ферментов рестрикции типа II. Каждый фермент назван по имени бактерии, из которой он был выделен, с использованием системы наименований, основанной на роде, виде и штамме. Например, название фермента рестрикции EcoRI было получено, как показано в приведенной таблице:

Разбор названия рестриктазы EcoRI
Часть аббревиатуры Значение Что описывает
E Escherichia родовое название
co coli видовое название
R RY13 штамм
I Первая порядок идентификации в бактерии

Изошизомеры, гетерошизомеры и изокаудомеры

править

Изошизомеры — это пары эндонуклеаз рестрикции, имеющих специфичность к распознаванию одинаковых последовательностей, но иногда отличающихся по наличию метилированных нуклеотидных остатков, и разрезающих эти последовательности в одинаковых местах. Например, изошизомерами являются рестриктазы Sph I (CGTAC^G) и Bbu I (CGTAC^G). Первый выделенный фермент для узнавания и специфического разрезания заданной последовательности, называют прототипом, а все остальные подобные рестриктазы называют изошизомерами.

Изошизомеры выделяют из разных штаммов бактерий и поэтому разные изошизомеры могут требовать разных условий реакции.

Гетерошизомеры (неошизомеры)

править

Фермент, узнающий такую же последовательность, но разрезающий её по-другому, называют гетерошизомером (неошизомером). Например, рестриктазы Sma I (GGG^CCC) и Xma I (G^GGCCC) являются гетерошизомерами, но не изошизомерами друг для друга.

Изокаудомеры

править

Эндонуклеазы рестрикции, распознающие совершенно разные последовательности, но образующие одинаковые концы, называют изокаудомерами.

Искусственные рестриктазы

править

В генной инженерии широко используются искусственные эндонуклеазы рестрикции, получаемые путём слияния ДНК-связывающего домена цинкового пальца с ДНК-разрезающим доменом нуклеазы[7][8]. Домен цинкового пальца может быть спроектирован так чтобы узнавать и связываться с желаемой последовательностью ДНК[9]. Альтернативой нуклеазам с цинковым пальцем являются искусственные ферменты рестрикции TALEN, получаемые путём слияния ДНК-связывающего домена TAL-эффектора с доменом расщепления ДНК[10][11][12][13].

Эндонуклеазы, работающие по «наводке» РНК

править

Для редактирования генома в клетках человека используются также эндонуклеазы системы CRISPR-Cas9, расщепляющие определённые последовательности ДНК по «наводке» комплементарной РНК[14][15][16][17][18][19]. В отличие от цинковых пальцев и TALEN, системе CRISPR-Cas для узнавания ДНК требуется только создание соответствующей последовательности РНК «гида», а не создание новых белковых доменов фермента, что делает этот метод гораздо более доступным благодаря простоте и сравнительной дешевизне[20][21][22][23][24].

Перспективной видится разработка Fanzor – гомологов CRISPR-Cas9, обнаруженных у Spizellomyces punctatus[25].

Значение

править

В практической молекулярной биологии чаще всего используются эндонуклеазы рестрикции II типа, сайт узнавания для которых в большинстве случаев представляет собой палиндром. Все эндонуклеазы рестрикции II типа — Mg2+-зависимы.

Эндонуклеазы рестрикции — часть сложной системы рестрикции-модификации, используемой бактериальными клетками для регуляции содержания и активности ДНК в клетке.

Открытие эндонуклеаз рестрикции в 1970-х годах вместе с разработкой способов секвенирования ДНК послужило основным толчком для развития генетической инженерии.

В настоящее время эндонуклеазы рестрикции с различными сайтами узнавания являются основным инструментом генетических исследований и генной инженерии.

См. также

править

Примечания

править
  1. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки: в трех томах. — 2. — Москва: Мир, 1994. — Т. 1. — 517 с. — 10 000 экз. — ISBN 5030019855.
  2. Айала Ф. Д. Современная генетика. 1987.
  3. Roberts R. J., Vincze T., Posfai J., Macelis D. REBASE--enzymes and genes for DNA restriction and modification (англ.) // Nucleic Acids Res[англ.] : journal. — 2007. — Vol. 35, no. Database issue. — P. D269—70. — doi:10.1093/nar/gkl891. — PMID 17202163.
  4. Primrose, Sandy B.; Old, R. W. Principles of gene manipulation: an introduction to genetic engineering (англ.). — Oxford: Blackwell Scientific, 1994. — ISBN 0-632-03712-1.
  5. Micklos, David A.; Bloom, Mark V.; Freyer, Greg A. Laboratory DNA science: an introduction to recombinant DNA techniques and methods of genome analysis (англ.). — Menlo Park, Calif: Benjamin/Cummings Pub. Co, 1996. — ISBN 0-8053-3040-2.
  6. Adrianne Massey; Helen Kreuzer. Recombinant DNA and Biotechnology: A Guide for Students (англ.). — Washington, D.C: ASM Press[англ.], 2001. — ISBN 1-55581-176-0.
  7. Carroll, D. (2011) Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics, 188(4), 773—782. doi:10.1534/genetics.111.131433
  8. Fujii W, Kano K, Sugiura K, Naito K (2013) Repeatable Construction Method for Engineered Zinc Finger Nuclease Based on Overlap Extension PCR and TA-Cloning. PLoS ONE 8(3): e59801. doi:10.1371/journal.pone.0059801
  9. Zhu, C., Gupta, A., Hall, V. L. et al. & Wolfe, S. A. (2013). Using defined finger-finger interfaces as units of assembly for constructing zinc-finger nucleases. Nucleic acids research, 41(4), 2455-246541 doi:10.1093/nar/gks1357.
  10. Mussolino, C., & Cathomen, T. (2012). TALE nucleases: tailored genome engineering made easy. Current Opinion in Biotechnology, 23(5), 644—650 doi:10.1016/j.copbio.2012.01.013
  11. Beumer, K. J., Trautman, J. K., Christian, M.,et al. & Carroll, D. (2013). Comparing Zinc Finger Nucleases and Transcription Activator-Like Effector Nucleases for Gene Targeting in Drosophila. G3: Genes| Genomes| Genetics, 3(10), 1717—1725 doi:10.1534/g3.113.007260
  12. Sun, N., & Zhao, H. (2013). Transcription activator‐like effector nucleases (TALENs): A highly efficient and versatile tool for genome editing. Biotechnology and bioengineering, 110(7), 1811—1821 doi:10.1002/bit.24890
  13. Zhang Z, Zhang S, Huang X, Orwig KE, Sheng Y (2013) Rapid Assembly of Customized TALENs into Multiple Delivery Systems. PLoS ONE 8(11): e80281. doi:10.1371/journal.pone.0080281
  14. Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., & Kim, J. S. (2013). Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature biotechnology, 31, 230—232. doi:10.1038/nbt.2507
  15. Hsu, P. D., Scott, D. A., Weinstein, J. A.,et al. & Zhang, F. (2013) DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology, 31(9), 827—832. doi:10.1038/nbt.2647
  16. Golic, K. G. (2013) RNA-Guided Nucleases: A New Era for Engineering the Genomes of Model and Nonmodel Organisms. Genetics, 195(2), 303—308. doi:10.1534/genetics.113.155093
  17. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., et al. & Zhang, F. (2013). Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols, 8(11), 2281—2308 doi:10.1038/nprot.2013.143
  18. Giedrius Gasiunas, Virginijus Siksnys (2013) RNA-dependent DNA endonuclease Cas9 of the CRISPR system: Holy Grail of genome editing? Архивная копия от 5 декабря 2013 на Wayback Machine Trends in Microbiology, 21(11), 562—567, doi:10.1016/j.tim.2013.09.001
  19. Luhan Yang, Prashant Mali, Caroline Kim-Kiselak, and George Church (2014) CRISPR-Cas Mediated Targeted Genome Editing in Human Cells. In: Gene Correction. Methods and Protocols. Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 1114 Storici, Francesca (Ed.) ISBN 978-1-62703-760-0
  20. Uri Ben-David (2013) Flowing through the CRISPR-CAScade: Will genome editing boost cell therapies? Архивная копия от 17 ноября 2015 на Wayback Machine Molecular and Cellular Therapies 2013, 1:3 doi:10.1186/2052-8426-1-3
  21. Neena K. Pyzocha, F. Ann Ran, Patrick D. Hsu, and Feng Zhang (2014) RNA-Guided Genome Editing of Mammalian Cells. In: Gene Correction. Methods and Protocols. Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 1114 Storici, Francesca (Ed.) ISBN 978-1-62703-760-0
  22. Li, M., Suzuki, K., Kim, N. Y., Liu, G. H., & Belmonte, J. C. I. (2013). A cut above the rest: targeted genome editing technologies in human pluripotent stem cells. Journal of Biological Chemistry, jbc-R113. doi:10.1074/jbc.R113.488247
  23. Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., & Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity (англ.) // Science : journal. — 2016. — Vol. 351, no. 6268. — P. 84—88. — doi:10.1126/science.aad5227.
  24. Kleinstiver B. P., Pattanayak V., Prew M. S., , & J. Keith Joung et al. High-fidelity CRISPR–Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects (англ.) // Nature : journal. — 2016. — doi:10.1038/nature16526.
  25. Makoto Saito, Peiyu Xu, Guilhem Faure, Samantha Maguire, Soumya Kannan, Han Altae-Tran, Sam Vo, AnAn Desimone, Rhiannon K. Macrae, Feng Zhang. Fanzor is a eukaryotic programmable RNA-guided endonuclease (англ.) // Nature. — 2023-08. — Vol. 620, iss. 7974. — P. 660–668. — ISSN 1476-4687. — doi:10.1038/s41586-023-06356-2. Архивировано 29 июня 2023 года.