Открыть главное меню

Кумасси

Coomassie Brilliant Blue (кумасси бриллиантовый синий) — название двух близких трифенилметановых красителей, разработанных для текстильной индустрии, но в настоящее время широко используемых в аналитической биохимии для окраски белков. Coomassie Brilliant Blue G-250 отличается от R-250 наличием двух метильных групп. Название «Coomassie» — зарегистрированный товарный знак Imperial Chemical Industries.

Coomassie Brilliant Blue
Coomassie Brilliant Blue R-250.svg
Общие
Традиционные названия C.I. 42660, C.I. Acid Blue 83
Brilliant indocyanine 6B, Brillantindocyanin 6B
Brilliant Cyanine 6B, Serva Blue R
Хим. формула C45H44N3NaO7S2 (натриевая соль)
Физические свойства
Молярная масса 825,97 г/моль
Химические свойства
Растворимость в воде нерастворимо в холодной воде, плохо растворимо в горячей воде, растворимо в этаноле
Классификация
Рег. номер CAS 6104-59-2
PubChem
Рег. номер EINECS 228-060-5
SMILES
InChI
ChemSpider
Безопасность
H-фразы H201, H202, H235+H410
P-фразы P201
Пиктограммы СГС Пиктограмма "Газовый баллон" согласованной на глобальном уровне системы классификации и маркировки химических веществ (СГС)Пиктограмма "Взрывающаяся бомба" согласованной на глобальном уровне системы классификации и маркировки химических веществ (СГС)
NFPA 704
NFPA 704.svg
Приводятся данные для стандартных условий (25 °C, 100 кПа), если не указано иного.

Содержание

Название и история открытияПравить

Название Кумасси было зарегистрировано в конце 19 века в качестве торговой марки компанией Blackley, для красителей шерсти.[1] В 1896 году в ходе Четвертой Англо-ашантийской войны, войска Великобритании заняли город Coomassie (в настоящее время Кумаси в Гане). В 1918 году компания Levinstein Ltd, владелец торговой марки Кумасси, стала частью компании British Dyestuffs, которая в 1926 году была поглощена компанией Imperial Chemical Industries.[2] В настоящее время компания Imperial Chemical Industries не производит красителей, но остается владельцем торговой марки Coomassie .

Синие красители на основе сернистных производных трифенилметана были впервые получены в 1913 году Максом Вейлером, который работал в городе Вупперталь (Германия).[3][4][5][6]

Статьи в биохимических журналах часто не расшифровывают, какой именно краситель «Coomassie» был использован. Перечень цветов en:Colour Index International содержит более 40 красителей, содержащих термин «Coomassie» в названии. Синий краситель кумасси из перечня Merck Index (10th edition) — Coomassie Blue RL (Acid Blue 92, C.I. 13390) имеет совершенно иную структуру.

Цвет красителяПравить

Суффикс «R» в названии красителя Coomassie Brilliant Blue R-250 является аббревиатурой от слова Red (красный), так как синий цвет красителя имеет слабый красноватый оттенок. Вариант красителя с суффиксом «G» имеет слабый зеленоватый оттенок. Цифры «250» обозначали чистоту красителя.

Цвет красителей зависит от кислотности среды. Краситель «G» подробно изучен.[7] При pH ниже 0 краситель имеет красную окраску и максимум поглощения на длине 470 нм. При pH около 1 краситель зеленый и максимум поглощения составляет 620 нм. При рН выше 2 краситель ярко-синий, максимум поглощения на 595. При pH 7 краситель имеет коэффициент молярной экстинкции 43,000 M−1см−1.[7]

Изменение окраски раствора соответствует изменению заряда молекулы красителя. В красной форме три атома азота заряжены положительно. Два остатка серной кислоты имеют очень низкий pKa и потому обычно заряжены отрицательно, поэтому при pH близких к нулю, краситель представляет собой катион с суммарным зарядом +1. Зеленый цвет соответствует незаряженной молекуле. При pH 7 лишь атом азота в составе дифениламина имеет положительный заряд, поэтому молекула в целом является анионом с суммарным зарядом −1. Значения pKa, необходимые для потери двух протонов составляют 1,15 и 1,82. Последний протон отрывается в щелочной среде, при этом молекула приобретает розовую окраску (pKa 12,4).[7]

Красители образуют комплекс с анионными детергентами, например, с лаурилсульфатом натрия.[8] Образование такого комплекса стабилизирует зеленый цвет нейтральной формы красителя. Этот эффект может оказывать влияние на определение концентрации при помощи метода Бредфорда. Вероятно, анионные детергенты конкурируют с красителем за связывание с белком.

Использование в биохимииПравить

Coomassie Brilliant Blue R-250 был использован для окрашивания белков в 1964 году[9]. Образцы белков были разделены электрофорезом на листе ацетата целлюлозы. Лист помещали в сульфосалициловую кислоту для фиксации белков и затем переносили в раствор красителя.

В 1965 году Coomassie Brilliant Blue R-250 был использован для окрашивания белков после электрофоретического разделения в полиакриламидном геле[10]. Гель помещали в раствор красителя, содержащий метанол, уксусную кислоту и воду. После окрашивания белков полиакриамидный гель (ПААГ) должен был быть отмыт электрофоретически. Далее было показано, что гель может быть отмыт раствором уксусной кислоты.

Краситель «G» был впервые использован для визуализации белков в полиакриламидном геле в 1967 году, при этом краситель растворяли в растворе уксусной кислоты с метанолом[11].

Позднее было показано, что белковые полосы могут быть окрашены без коллоидного красителя «G», в растворе трихлоруксусной кислоты без метанола. Использование этого протокола не требует отмывания геля[12].

Современные протоколы используют коллоидную форму красителя «G» в растворе, содержащем фосфорную кислоту, этанол (или метанол) и сульфат аммония[13][14][15][16].

Метод Бредфорда использует спектральные свойства Coomassie Brilliant Blue G-250 для определения количества белка в растворе[17]. Для этого к образцу белка добавляют раствор красителя в фосфорной кислоте и этаноле. В кислых условиях краска имеет коричневый цвет, но при связывании с белком становится синей. Оптическое поглощение раствора измеряют на длине волны 595 нм.

Связывание белка с отрицательно заряженным Coomassie Brilliant Blue G-250 придаёт белку отрицательный заряд, что может быть использовано при разделении смесей белков в ПААГ в неденатурирующих условиях при помощи метода Blue Native PAGE[18][19].

Подвижность комплекса в полиакриламидном геле зависит от размера белка, белкового комплекса, а также количества красителя, связываемого белком.

См. такжеПравить

ПримечанияПравить

  1. Fox, M. R. Dye-makers of Great Britain 1856-1976 : A History of Chemists, Companies, Products and Changes. — Manchester : Imperial Chemical Industries, 1987. — P. 38.
  2. Fox, M. R. Dye-makers of Great Britain 1856-1976 : A History of Chemists, Companies, Products and Changes. — Manchester : Imperial Chemical Industries, 1987. — P. 259.
  3. Colour Index. — 3rd. — Bradford : Society of Dyers and Colourists, 1971. — Vol. 4. — P. 4397–4398. Архивная копия от 19 июля 2011 на Wayback Machine
  4. , "Procédé de production de colorants de la série du triarylméthane", FR patent 474260, issued 1915-02-16
  5. Weiler, Max, "Blue Triphenylmethane Dye", US patent 1218232, issued 1917-03-06
  6. , "Manufacture of Triarylmethane-dyestuffs", GB patent 275609, issued 1927-11-03
  7. 1 2 3 Chial, H. J.; Thompson, H. B.; Splittgerber, A. G. (1993). “A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G”. Analytical Biochemistry. 209 (2): 258—266. DOI:10.1006/abio.1993.1117. PMID 7682385.
  8. Compton, S. J.; Jones, C. G. (1985). “Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay”. Analytical Biochemistry. 151 (2): 369—374. DOI:10.1016/0003-2697(85)90190-3. PMID 4096375.
  9. Fazekas de St. Groth, S.; Webster, R. G.; Datyner, A. (1963). “Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips”. Biochimica et Biophysica Acta. 71: 377—391. DOI:10.1016/0006-3002(63)91092-8. PMID 18421828.
  10. Meyer, T. S.; Lambert, B. L. (1965). “Use of Coomassie brilliant blue R250 for the electrophoresis of microgram quantities of parotid saliva proteins on acrylamide-gel strips”. Biochimica et Biophysica Acta. 107 (1): 144—145. DOI:10.1016/0304-4165(65)90403-4. PMID 4159310.
  11. Altschul, A. M.; Evans, W. J. (1967). “Zone electrophoresis with polyacrylamide gel”. Methods in Enzymology. 11: 179—186. DOI:10.1016/S0076-6879(67)11019-7.. Page 184 personal communication from W. J. Saphonov.
  12. Diezel, W.; Kopperschläger, G.; Hofmann, E. (1972). “An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue”. Analytical Biochemistry. 48 (2): 617—620. DOI:10.1016/0003-2697(72)90117-0. PMID 4115985.
  13. Neuhoff, V.; Stamm, R.; Eibl, H. (1985). “Clear background and highly sensitive protein staining with Coomassie Blue dyes in polyacrylamide gels: a systematic analysis”. Electrophoresis. 6 (9): 427—448. DOI:10.1002/elps.1150060905.
  14. Candiano, G.; Bruschi, M.; Musante, L.; Santucci, L.; Ghiggeri, G. M.; Carnemolla, B.; Orecchia, P.; Zardi, L.; Righetti, P. G. (2004). “Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis”. Electrophoresis. 25 (9): 1327—1333. DOI:10.1002/elps.200305844. PMID 15174055.
  15. Steinberg, T. H. (2009). “Protein gel staining methods: an introduction and overview”. Methods in Enzymology. 463: 541—563. DOI:10.1016/S0076-6879(09)63031-7. PMID 19892191.
  16. Pink, M.; Verma, N.; Rettenmeier, A. W.; Schmitz-Spanke, S. (2010). “CBB staining protocol with higher sensitivity and mass spectrometric compatibility”. Electrophoresis. 31 (4): 593—598. DOI:10.1002/elps.200900481. PMID 20162584.
  17. Bradford, M. M. (1976). “Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”. Analytical Biochemistry. 72: 248—254. DOI:10.1016/0003-2697(76)90527-3. PMID 942051.
  18. Schägger, H.; Jagow, G. (1991). “Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form”. Analytical Biochemistry. 199 (2): 223—231. DOI:10.1016/0003-2697(91)90094-A. PMID 1812789.
  19. Wittig, I.; Braun, H. P.; Schägger, H. (2006). “Blue native PAGE”. Nature Protocols. 1 (1): 418—428. DOI:10.1038/nprot.2006.62. PMID 17406264.

ЛитератураПравить

ПротоколыПравить