Проточная цитометрия

Проточная цитометрия (проточная цитофлуориметрия) — метод исследования дисперсных сред в режиме поштучного анализа элементов дисперсной фазы по сигналам светорассеяния и флуоресценции. Название метода связано с основным приложением, а именно, с исследованием одиночных биологических клеток в потоке.

Схема оборудования для проведения проточной цитометрии.

Основа метода заключается в 1) использовании системы гидрофокусировки, которая обеспечивает прохождение клеток в потоке поодиночке; 2) облучении клетки лазерным излучением; 3) регистрации сигналов светорассеяния и флуоресценции от каждой клетки.

Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Образцы

• кровь
• костный мозг
• ликвор
• суставная жидкость
• плевральная жидкость
• асцитическая жидкость
• суспендированные клетки тканей (например, опухолей)

Принцип

Принцип работы гидрофокусирующей системы

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. Гидродинамическая фокусировка обеспечивается большим удельным расходом во внешней струе (струя-оболочка) по сравнению с удельным расходом пробы. Схематически принцип работы показан на видео. При увеличении удельного расхода во внешней струе, клетки выстраиваются в линию, одна за другой. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

• рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°).
• рассеяние света под углом 90°.
• интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности (от 2 до 18-20).

Интенсивность рассеяния зависит от морфологии клетки (размер, форма, внутренняя структура), от ориентации клетки в потоке относительно направления падающего излучения, от состояния поляризации падающего излучения.

Интенсивность флуоресценции формируется за счет двух вкладов: специфической флуоресценции и автофлуоресценции. Специфическая флуоресценция связана с излучением молекул флуорохрома, специфически связанных с определенными клеточными компонентами (рецепторы, внутриклеточные белки, ДНК и др.). Автофлуоресценция связана с излучением собственных молекул клетки (белки, нуклеиновые кислоты и т.д.). Интенсивность специфической флуоресценции зависит от количества молекул флуорохрома в клетке, длины волны возбуждающего излучения, сечения поглощения (экстинкции) флуорохрома на этой длине волны, квантового выхода флуорохрома, числовой апертуры оптической системы сбора флуоресценции, спектрального диапазона системы оптической фильтрации и детекции. Интенсивность автофлуоресценции аналогичным образом зависит от оптических свойств собственных молекул клетки. На практике подготовка клеток перед измерением осуществляется таким образом, чтобы вклад специфической флуоресценции на несколько порядков превышал вклад автофлуоресценции.

Приборы

Приборы для анализа клеток методом проточной цитометрии называются проточными цитометрами, или проточными цитофлуориметрами. Самыми популярными на территории России и СНГ проточными цитометрами являются приборы компаний Beckman Coulter Life Sciences и Becton Dickinson Biosciences.

Флуорохромы

• Флуоресцеина изотиоцианат (FITC)
• Фикоэритрин (PE, RD1)
• Перидинин-Хлорофилл Протеин (Per-CP)
• Алофикоцианин (APC)

Тандемные красители:

• Фикоэритрин — Техасский красный (ECD)
• Фикоэритрин — Cy5 (PC5)
• Фикоэритрин — Cy7 (PC7)
• Аллофикоцианин- Cy7 (APC-Cy7)

«Квантовые точки» QD560, QD590 и т. д.

Преимущества

• короткое время анализа за счет высокой скорости (до 100 000 событий в секунду)
• анализ большого количества клеток (до 10⁸ клеток в мл)
• определение субпопуляций клеток
• измерение параметров редко встречающихся клеток
• объективное измерение интенсивности флуоресценции

Применение

Иммунология

• иммунофенотипирование клеток периферической крови
• определение фагоцитарной активности (захват меченных флюорохромами бактерий или дрожжей)
• определение внутриклеточных цитокинов (спонтанная продукция и под действием различных специфических или неспецифических активаторов, таких как ФМА + иономицин, ЛПС, ФНО-альфа)
• определение внутриклеточных белков, например транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FoxP3 для дискриминации CD4 Т-лимфоцитов
• определение пролиферативной активности (выявление инкорпорированого бромдезоксиуридина)
• исследование клеточного цикла
• оценка клеточной цитотоксичности

Онкология

• количественный анализ внутриклеточных компонентов (ДНК)
• анализ стадий клеточного цикла
• выявление анеуплоидного клона
• определение пролиферативной активности анеуплоидного клона
• определение специфических маркеров
• позволяет проводить наблюдение пациентов, входящих в группу риска
• оценка состояния иммунной системы:
• оценка клеточного звена иммунитета (определение субпопуляций лимфоцитов)
• оценка функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток (NK тест, фагоцитарный тест и т. п.)

Цитология

• определение цитоморфологической принадлежности клетки: размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток
• оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов
• определение экспрессии поверхностных антигенов
• анализ стадий клеточного цикла
• измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный pH, концентрация свободных ионов Ca²⁺, потенциал наружной клеточной мембраны)

Гематология

• анализ субпопуляционного состава клеток периферической крови
• подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по специфическим маркерам
• дифференциальная диагностика лимфопролиферативных заболеваний и реактивных лимфоцитозов
• диагностика лимфопролиферативных заболеваний
• диагностика острых лейкозов
• оценка минимальной резидуальной болезни

Фармакология

• измерение экспрессии маркеров
• измерение активности внутриклеточных ферментов
• определений стадий клеточного цикла в рамках изучения механизмов воздействия различных биологически активных веществ на клеточном уровне

Растениеводство / Сельское хозяйство

• определение плоидности клеток
• анализ клеточного цикла
• анализ и сортировка протопластов

Литература

1. Davey H. Flow cytometry for clinical microbiology. CLI 2004; 2/3:12-5.
2. Shapiro H.M. «Practical Flow Cytometry», Alan Liss, .N.Y., 1985.